[发明专利]生产聚羟基丁酸－戊酸酯的基因工程菌及其构建方法与应用在审
| 申请号： | 201410758183.3 | 申请日： | 2014-12-10 |
| 公开（公告）号： | CN104450594A | 公开（公告）日： | 2015-03-25 |
| 发明（设计）人： | 丁久元;张英姿;刘桂明;翁维琦;刘双江 | 申请（专利权）人： | 中国科学院微生物研究所 |
| 主分类号： | C12N1/21 | 分类号： | C12N1/21;C12N15/74;C12P7/62;C12R1/01 |
| 代理公司： | 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245 | 代理人： | 关畅;陈晓庆 |
| 地址： | 100101 北*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 生产 羟基 丁酸 戊酸 基因工程 及其 构建 方法 应用 | ||
1.重组菌，包括将甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的编码基因yliK、GTP激酶的编码基因argK和甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的编码基因ygfG导入宿主真氧罗氏菌Ralstonia eutropha，得到所述重组菌。
2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述宿主真氧罗氏菌为真氧罗氏菌Rem-1或真氧罗氏菌Rem-3或真氧罗氏菌Rem-5或真氧罗氏菌Rem-7；
所述Rem-3是真氧罗氏菌Rem-1缺失2-甲基柠檬酸合酶-1基因prpC1后得到的菌；
所述Rem-5是真氧罗氏菌Rem-1缺失2-甲基柠檬酸合酶-2基因prpC2后得到的菌；
所述Rem-7是真氧罗氏菌Rem-1缺失所述2-甲基柠檬酸合酶-1基因prpC1和所述2-甲基柠檬酸合酶-2基因prpC2后得到的菌；
所述2-甲基柠檬酸合酶-1的氨基酸序列如序列表中序列2所示；
所述2-甲基柠檬酸合酶-2的氨基酸序列如序列表中序列5所示。
3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于：所述甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的编码基因yliK、所述GTP激酶的编码基因argK和所述甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的编码基因ygfG通过重组表达载体pZMwf导入所述宿主真氧罗氏菌；
所述重组表达载体pZMwf的构建方法包括如下步骤：将如序列表中序列7所示的yliK-argK-ygfG基因簇片段插入表达载体pLXM1的多克隆位点中，得到的重组载体记作pZMwf；
所述甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的氨基酸序列如序列表中序列8所示；
所述GTP激酶的氨基酸序列如序列表中序列9所示；
所述甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的氨基酸序列如序列表中序列10所示。
4.含有甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的编码基因yliK、GTP激酶的编码基因argK和甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的编码基因ygfG的重组表达载体；
所述甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的氨基酸序列如序列表中序列8所示；
所述GTP激酶的氨基酸序列如序列表中序列9所示；
所述甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的氨基酸序列如序列表中序列10所示。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是将含有yliK-argK-ygfG基因簇片段插入表达载体pLXM1的多克隆位点中得到的。
6.权利要求2所述的Rem-3或权利要求2所述的Rem-5或权利要求2所述的Rem-7。
7.权利要求1-3任一所述的重组菌或权利要求4或5所述的重组表达载体或权利要求6所述的Rem-3或Rem-5或Rem-7在生产聚羟基丁酸－戊酸酯中的应用。
8.权利要求1-3任一所述的重组菌或权利要求4或5所述的重组表达载体或权利要求6所述的Rem-3或Rem-5或Rem-7在提高菌株合成PHBV中3HV组分含量中的应用。
9.一种生产聚羟基丁酸－戊酸酯的方法，包括如下步骤：以葡萄糖为底物，发酵培养权利要求1-3任一所述的重组菌或权利要求6所述的Rem-3或Rem-5或Rem-7，得到所述聚羟基丁酸－戊酸酯。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的培养基中不含有丙酸或丙酸盐或戊酸或戊酸盐。
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