[发明专利]生产聚羟基丁酸－戊酸酯的基因工程菌及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及生产聚羟基丁酸－戊酸酯的基因工程菌及其构建方法与应用。

背景技术

由于塑料工业对石油的依赖性以及塑料废弃物对环境的污染的严重性，迫使人们去寻找能替代化工塑料的环保的可持续发展的材料。聚-3-羟基丁酸酯(以下简称聚羟基丁酸酯，PHB)是基于生物基生产并可以被生物降解的高分子材料，其性能类似塑料。但是PHB性脆，后处理加工有一定的难度，若在PHB中掺入3-羟基戊酸(3HV)组分，得到的聚-3-羟基丁酸共聚3-羟基戊酸酯(以下简称聚羟基丁酸－戊酸酯，PHBV)可以使材料的性能获得改善，硬度、强度、熔点均下降，但分解温度不降，这更利于拓宽产品的应用范围。PHBV可用于组织和器官修复的支架平台，缓释药物的外包装，骨再生引导膜，构建心脏生物瓣膜，医用纺织品，可降解包装材料和吸附材料等等。

目前规模化生产PHBV时使用的唯一生产用菌株是真养罗氏菌突变株，但需要在培养时添加丙酸(盐)或戊酸(盐)。丙酸(盐)合成丙酰辅酶A，丙酰辅酶A与乙酰辅酶A缩合生成戊酰辅酶A，是合成3-羟基戊酸(3HV)的直接前体物，戊酸(盐)可以直接合成戊酰辅酶A。而丙酸(盐)或戊酸(盐)有细胞毒性，且价格较贵。因此，现有技术生产PHBV时需要严格控制丙酸(盐)或戊酸(盐)的流加过程，既达到一定的细胞量，又能够满足丙酰辅酶A合成的需要。现有技术生产PHBV的控制过程复杂且增加了生产成本，使应用受限。近些年来，研究人员利用基因工程技术改造菌株，但菌株的性能远达不到实现商业化生产的要求，且宿主菌或为致病菌。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种重组菌。

本发明提供的重组菌是将甲基丙二酸单酰辅酶A变位酶的编码基因yliK、GTP激酶的编码基因argK和甲基丙二酸单酰辅酶A脱羧酶的编码基因ygfG导入宿主真氧罗氏菌Ralstonia eutropha得到的。

上述重组菌中，所述宿主真氧罗氏菌为真氧罗氏菌Rem-1或真氧罗氏菌Rem-3或真氧罗氏菌Rem-5或真氧罗氏菌Rem-7。

上述重组菌中，所述Rem-3是真氧罗氏菌Rem-1缺失2-甲基柠檬酸合酶-1基因prpC1后得到的菌；所述真氧罗氏菌Rem-1可以通过同源重组敲除prpC1基因，或者通过插入灭活prpC1基因，还可以通过诱变获得prpC1基因缺失的菌株；所述Rem-3的具体获得方法是：

(1)将如序列表中序列3所示的DNA片段插入pJQ200mp18Tc载体的多克隆位点，得到的重组载体记作pJQ200mp18Tc：：ΔprpC1；

(2)将所述pJQ200mp18Tc：：ΔprpC1载体转化E.coli S17-1，得到的重组菌记作ΔprpC1pJQ200/S17-1，作为供体菌；

(3)以Rem-1为受体菌，将所述供体菌ΔprpC1pJQ200/S17-1与受体菌Rem-1进行接合转移，使Rem-1中的prpC1基因缺失，得到的重组菌即为所述Rem-3。

上述重组菌中，所述Rem-5是真氧罗氏菌Rem-1缺失2-甲基柠檬酸合酶-2基因prpC2后得到的菌；所述真氧罗氏菌Rem-1可以通过同源重组敲除prpC2基因，或者通过插入灭活prpC2基因，还可以通过诱变获得prpC2基因缺失的菌株；所述Rem-5的具体获得方法是：

(1)将如序列表中序列6所示的DNA片段插入pJQ200mp18Tc载体的多克隆位点，得到的重组载体记作pJQ200mp18Tc：：ΔprpC2；

(2)将所述pJQ200mp18Tc：：ΔprpC2载体转化E.coli S17-1，得到的重组菌记作ΔprpC2pJQ200/S17-1，作为供体菌；

(3)以Rem-1为受体菌，将所述供体菌ΔprpC2pJQ200/S17-1与受体菌Rem-1进行接合转移，得到prpC2基因缺失的Rem-1记作ΔprpC2/Rem-1，即所述Rem-5。