[发明专利]一种Aus Man5A-CBM27融合酶的设计及制备方法

权利要求书

1.一种底物亲和力强、催化效率高的Aus Man5A-CBM27融合酶，其核苷酸和氨基酸序列分别为：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。

2.融合酶工程菌的构建和表达方法：

(1)CBM27数据库的建立：基于在Carbohydrate-Active enZYmes Database(http://www.cazy.org/)中收录的各种CBM信息，选取CBM27家族(主要是甘露聚糖结合结构域)的成员构建一个CBM27数据库；

(2)CBM27进化树的构建：使用ClustalX软件对构建的CBM27数据库中的成员进行多序列同源比对并结合进化树绘制软件(MEGA4)，构建CBM27进化树。其制作方式为Neighbor-Joining法，计算模型选择Poisson Correction，制作过程中引入Bootstrap检测(Bootstrap Replications＝10000)以确保较高的可信度；

(3)CBM27与底物模型分子的分子对接和分子动力学模拟：根据CBM进化树从CBM27家族选择多个具有代表性的CBM，使用AutoDock 4.2软件将它们分别与甘露二糖模型分子进行分子对接分析，再使用Gromacs 4.5软件进行分子动力学模拟分析，依据CBM与模型分子间的结合模式和结合力大小，最终选定最优的CBM即海栖热袍菌甘露聚糖酶的CBM融合到Aus Man5A的羧基端；

(4)融合酶基因及其表达质粒的构建：基于上述设计的融合酶基因序列，用重叠PCR技术将Aus Man5A的基因序列与CBM27的核苷酸序列融合，重叠PCR涉及到的两对引物分别为：

AMan5A-F1:5’-GAATTCTCCTTCGCCAGCACCTC-3’，

AMan5A-R1:5’-GTATCTTGCGCTACCTCCAGGCGGTG-3’，

CBM-F2:5’-GGTAGCGCAAGATACGTGTTGGCAG-3’，

CBM-R2:5’-GCGGCCGCCTATGTTCTTTTATAAAGTCTCAC-3’，

采用重叠PCR技术构造融合基因man5A-cbm27，主要分为四步：以AMan5A-F1和AMan5A-R1为引物进行第一轮PCR,合成待融合的宇佐美曲霉Aus Man5A的基因片段；以CBM-F2和CBM-R2为引物进行第二轮PCR，合成待融合的CBM的基因片段；将两轮PCR产物分别用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带，分别以上述产物互为引物和模板，进行第三轮PCR；以第三轮PCR反应产物为模板，分别以AMan5A-F1和CBM-R2为引物进行第四轮PCR。将第四轮PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-man5A-cbm27)，转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序；将测序正确的pUCm-T-man5A-cbm27与pPIC9K质粒均用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ进行双酶切，回收的酶切产物在T4 DNA连接酶的作用下连接，得到重组质粒pPIC9K-man5A-cbm27，并对重组表达质粒进行序列测定；

(5)GS115/man5A-cbm27的构建、表达、产物纯化及性质测定：用Sal Ⅰ对pPIC9K-man5A-cbm27进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/man5A-cbm27；该基因工程菌用1.0％甲醇诱导表达96h，采用DNS法测得发酵液中甘露聚糖酶活性达26IU/mL；发酵液经离心后的上清液为融合酶的粗酶液，该粗酶液经截留分子量为10,000Da的超滤膜浓缩，再经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-75凝胶过滤层析纯化，纯化后经SDS-PAGE检测为单一条带，并显示融合酶的分子量为60kDa；该融合酶的最适作用温度65℃，最适作用pH 4，该酶在pH 2.0-9.0、68℃以下稳定。