[发明专利]一种Aus Man5A-CBM27融合酶的设计及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及宇佐美曲霉Aus Man5A-CBM27融合酶基因的构建和表达，以及该酶的性质和应用研究，属于生物工程技术领域。

背景技术

β-1,4-D-甘露聚糖酶(β-1,4-D-mannan mannohydrolase；EC 3.2.1.78)，简称β-甘露聚糖酶(β-mannanase)，是指一类能够水解含有β-1,4-D-甘露糖苷键的甘露聚糖和异甘露聚糖的内切水解酶，它在动植物和微生物中均广泛存在。近年来，β-甘露聚糖酶在食品、饲料、医药、制浆造纸、石油开采等多种行业都具有广泛的应用前景，受到很多研究者的青睐。在食品领域中，β-甘露聚糖酶可用于生产功能性低聚糖，改善人体肠道菌群，提高人体免疫力；也可以用于啤酒果汁的澄清，酒类酿造，速溶咖啡的生产等。在饲料工业中，β-甘露聚糖酶的添加应用，可降低甘露聚糖的抗营养作用，提高饲料的利用率。在造纸工业中，β-甘露聚糖酶和β-木聚糖酶等半纤维素降解酶类协同使用，处理纸浆，能明显改善纸质。将β-甘露聚糖酶运用纺织印染的漂白工艺中，能有效地去除产品上粘附的多余染料，更可以减少氯和碱的用量以及它们带来的环境污染问题，有利于生态环境的保护。根据序列同源性和空间结构分析，多数β-甘露聚糖酶都属于糖苷水解酶第5、26和113家族。目前，关于第5家族β-甘露聚糖酶的报道较多，它们的最适pH值为3.0～7.5，最适温度在45～92℃。

近年来，随着对自然界中半纤维素资源的开发、饲粮中甘露聚糖抗营养因子的消除以及甘露寡糖生理功能的发现，β-甘露聚糖酶的需求量越来越大，导致对β-甘露聚糖酶的研究和开发进入一个新高潮。但目前，已商品化的β-甘露聚糖酶，尤其是国内公司开发出的一些产品，在酶学性质和生产水平等方面尚存在一定的缺陷，例如较低的底物亲和力和比酶活以及较差的对极端环境的耐受性等，这些都限制了它们在工业生产中广泛和有效的应用。如何不断在新发现的微生物来源β-甘露聚糖酶中改造和筛选出底物亲和力强、比酶活高、极端环境耐受性好的优良酶，并有效地应用于工业生产中，已成为现在面临的最大挑战。进入90年代，随着基因工程技术和蛋白质工程技术的广泛应用，研究者越来越注重于酶基因的克隆和表达以及酶活性位点的研究等方面。目前，虽已有一些有关β-甘露聚糖酶基因的克隆和表达的文献和专利报道，但有关基于理性设计的甘露聚糖酶的分子改造，尤其是关于融合酶基因设计和表达的研究更是鲜有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种底物亲和力强、催化效率高的Aus Man5A-CBM27融合酶的设计与制备方法，对原有的宇佐美曲霉Man5A进行了分子改造。

本发明的技术方案：将原有的宇佐美曲霉Man5A与海栖热袍菌β-甘露聚糖酶中所属27家族的碳水化合物结合结构域(CBM)融合，构建出Aus Man5A-CBM27融合酶，融合酶的核苷酸序列为SEQ ID NO:1，相应的基因命名为man5A-cbm27。

所述的融合酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

携带有宇佐美曲霉Aus Man5A基因的重组质粒pUCm-T-man5A由江南大学构建和保藏(专利申请号：201010550927.4)。

CBM27的基因序列由上海生工合成。

所述的融合酶的活性测定方法：

于两个25mL的具塞试管A和B中，分别加入用pH 3.6、柠檬酸-磷酸二氢钠缓冲液配制的质量浓度为0.5％的角豆胶溶液2.4mL，于50℃恒温水浴中预热10min后，在A管中加入用缓冲液适当稀释的0.1mL酶液，于50℃中准确反应15min；立即在A和B两管中各加入2.4mL 3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂，在B管中再补加0.1mL灭活的酶液，A和B管同时煮沸7min；立即冷却后各加去离子水5mL，摇匀；以B管为空白对照，于540nm处测定A管吸光度值，并从甘露糖标准曲线上查出相应的还原糖(以甘露糖计)含量并折算成酶活性单位。酶活性单位定义：在本测定条件下，以每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量定义为1个β-甘露聚糖酶活性单位(U)。

所述的融合酶的设计和制备方法：

(1)CBM27数据库的建立：基于在Carbohydrate-Active enZYmes Database(http://www.cazy.org/)中收录的各种CBM信息，选取CBM27家族(主要与甘露聚糖结合)的成员构建一个CBM27数据库。