[发明专利]高温木质纤维素酶协同酶解制备可发酵糖的方法

说明书

木质纤维素原料酶解成本高是实现其生物转化的主要障碍，极端嗜热菌有独特的木质纤维素酶系，对天然木质纤维素原料有强降解作用。本发明以木聚糖、秸秆等为底物诱导极端嗜热菌产生木质纤维素酶系，提取胞内和胞外酶具有完备的半纤维素酶和纤维素酶系，能直接降解秸秆等原料，用胞内酶和胞外酶按一定比例混合后与商业化的纤维素酶协同酶解，半纤维素和纤维素的酶解率达到80％以上。本发明所提供的酶解方法可直接酶解天然木质纤维素原料，免去生物质预处理步骤，降低综合生产成本以，避免了预处理过程产生的抑制物对对后续生物转化的不利影响，清洁环保，没有糖损失，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明属于生物质高效转化领域，特别涉及一种高温木质纤维素酶协同酶解制备可发酵糖的方法。

背景技术：

利用木质纤维素原料替代化石资源生产生物能源和化学品，是实现人类社会可持续发展的需要。然而,其生物转化受到纤维素水解困难的限制，这是因为秸秆的主要成分(纤维素、半纤维素和木质素)紧紧地相拥在一起，形成木质素和碳水化合物复合体，是抗微生物降解的屏障。因此，木质纤维素转化为可发酵糖，是利用可再生资源代替化石燃料满足日益增长的能源需求的一个重大挑战。酶法水解是最常见的纤维素和半纤维素降解成可发酵糖如葡萄糖和木糖的方法。目前，酶解过程的高成本是限制生物燃料和生物化学品工业化生产的主要障碍。寻找高效纤维素酶和半纤维素酶制剂同时开发高效的酶解方式是克服这一障碍的主要手段，已成为全球研究的热点之一。

许多极端嗜热菌能够利用各种碳水化合物相关的木质纤维素原料转化为生物能源。这些极端嗜热细菌产生的新颖而独特的酶可能会给生物燃料和化学品的产生带来新的机会。其中, 热解纤维素菌属(Caldicellulosiruptor)是迄今发现的最耐热的一类生物质利用细菌，可以在较高温度(70-90℃)下生长，迄今，热解纤维素菌属已经有8个种(C.saccharolyticus,C.bescii, C.obsidiansis C.hydrothermalis,C.kristjanssonii,C.kronotskyensis,C.lactoaceticus,and C. owensensis)在欧洲、北美洲、亚洲和澳洲等地先后被发现。Caldicellulosiruptor属极端嗜热菌由于它可以产生多样化的糖苷水解酶水解木质纤维素，被认为具有广泛的应用前景。生物信息学方法分析发现(Blumer et al.,Journal of bacteriology.2012),Caldicellulosiruptor基因组编码 106糖苷水解酶分布在43个糖苷水解酶家族。而且从其基因组中发现了许多纤维素酶和半纤维素酶基因簇。一些新颖高效且热稳定高的木质纤维素酶已得到异源表达。特别是一些酶不仅有多个结构域，而且拥有多种催化功能，它们的结构和酶解方式不同于其余两个普通的纤维素酶系统：一个是产生游离的单个的纤维素酶和半纤维素酶，如真菌和大多数细菌产生的纤维素酶(Martinez,Nature Biotechnology 2008)，另一个是有多个水解酶自组装到一个常见的蛋白质支架形成大分子聚合体，称为纤维小体cellulosome(Bayer,Annual Review ofMicrobiology.2004)例如，C.bescii产生的一个复合纤维素酶CelA，包含一个第9家族糖苷水解酶和一个第48家族糖苷水解酶催化结构域，已发现该酶酶解纤维素的方式非常独特，除了能以普通的酶解方式从表面切割酶解纤维素外，还能以挖掘深入到纤维内部进行酶解(Brunecky,Science.2013)。目前商业化的纤维素酶和半纤维素酶主要由真菌产生。由于Caldicellulosiruptor属高温菌能产生与真菌不同的纤维素酶系统，在酶解木质纤维素时，它们与真菌纤维素酶具有互补性，应用Caldicellulosiruptor属的菌种高温纤维素酶与商业化的真菌纤维素酶协同酶解将产生更好的酶解效率，因此具有潜在的商业应用价值。然而，其应用价值远没有被开发出来，目前主要是将其中的一些木质纤维素酶基因进行异源表达，并研究了其酶学特性，没有对不同底物诱导产生复合纤维素酶系作为整体与商业化纤维素酶协同作用进行研究。本发明提供一种高效的以Caldicellulosiruptor属产生的高温木质纤维素复合酶与商业化维素酶协同酶解制备可发酵糖的方法，具有工业化应用前景。