[发明专利]一种花生果腐病病原菌的快速培养方法有效
| 申请号： | 201410760553.7 | 申请日： | 2014-12-12 |
| 公开（公告）号： | CN104762215B | 公开（公告）日： | 2020-04-21 |
| 发明（设计）人： | 陈明娜;禹山林;王冕;潘丽娟;迟晓元;陈娜;王通;杨珍 | 申请（专利权）人： | 山东省花生研究所 |
| 主分类号： | C12N1/14 | 分类号： | C12N1/14;C12R1/645 |
| 代理公司： | 山东三邦知识产权代理事务所(普通合伙) 37308 | 代理人： | 肖太升;高洋 |
| 地址： | 266600 山*** | 国省代码： | 山东;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 花生 果腐病 病原菌 快速 培养 方法 | ||
1.一种花生果腐病病原菌的快速培养方法，其特征在于：采用打孔法将分离、纯化的高致病性花生果腐病病原菌Calonectria sp.转接到改良察氏液体培养基上富集培养，之后将富集液涂布到改良察氏培养基平板上暗培养；如此对所得纯培养进行快速传代，选取经50 次传代后致病性稳定的菌株进行保藏；对冻存菌，则采用先活化、后富集、之后扩大培养的方法，实现快速、大量培养的目的，以满足花生抗病种质筛选短期内的大量需求；
所述的富集培养是用打孔法将5mm 直径的纯培养菌斑转接到盛有20ml 改良察氏液体培养基的三角瓶中，于摇床中以28℃、200rpm 震荡12h ；然后取1ml 富集液涂布到改良察氏培养基平板上，至少做5 个重复，暗培养2 天，选取光滑、湿润、粘稠的菌落进行传代培养；
所述的改良察氏培养基配方为硝酸钠2g，磷酸氢二钾0.7g，磷酸二氢钾0.3g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸亚铁0.01g，吐温0.5g，蔗糖30g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，PH 为6.8；
所述的活化是指用接种针挑取甘油冻存菌到盛有5ml 改良察氏液体培养基的10ml 离心管中，于摇床中以28℃、200rpm 震荡6-8h；
所述的富集是指将所述的5ml 培养液移入盛有50ml 改良察氏液体培养基的三角烧瓶中，28℃、200rpm 震荡16h；
所述扩大培养是指取1.5ml所述的富集培养液，涂布于12cm 直径的改良察氏培养基平板上，存留于超净工作台晾干后，按上述方法重复涂布两次，待晾干后置于培养箱28℃暗培养；
所述的花生果腐病病原菌是从花生果腐病病果中分离纯化获得，回接实验证明其具有高致病性，其ITS序列经比对与Calonectria morganii相似度为99% ；该菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014.10.20，保藏号为CGMCC No.9807。
2.如权利要求1所述的花生果腐病病原菌的快速培养方法，其特征在于：所述的花生果腐病病原菌的ITS 序列为：TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAA
CTCCCAAACCCCATGTGAACATACCTGTTTCGTTCCCTCGGCGGTGTCCGGCAACGGCCCGCCAGAGGACCCAACAAACTCTTTTGAATTTTTCAGTATCTTCTGAGTGAAAAAAACAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCACCTTCGGGAGCTTGGTGTTGGGGATCGGCAGGGCGTCCTCCGGGTCGCGCCGTCCCCCAAATCTAGTGGCGGTCTCGCTGTAGCTTCCTCTGCGTAGTAATACACCTCGCTCTGGAGTCTCGGTGCGGCCACGCCGTTAAACCCCCAACTATTTTCTGGTTGACCTCGAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGG。
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