[发明专利]一种快速高效的农杆菌介导的水稻茎尖遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术领域和植物基因工程领域，具体是一种快速高效农杆菌介导的水稻转化方法。

背景技术

水稻是世界上重要的粮食作物之一，世界上超过半数的人口以水稻为主食，其稳定供给直接影响全球的粮食平衡。培育各种优质的水稻是解决日益凸显的粮食问题和环境问题的途径之一。常规的水稻杂交育种，周期长，见效慢，并存在基因连锁和生殖隔离的缺点。借助于一些理化条件的诱变育种，难以控制诱变的方向，有益突变率低。以细胞融合的方式获得杂种细胞，培养并发育成植株的细胞工程育种，技术复杂，效率低。目前，采用基因工程的技术获得水稻新品种是最高效的育种方式之一。

自1988年首例转基因水稻获得成功以来，包括基因枪法、电击法、PEG法、花粉管通道法及农杆菌介导等多种遗传转化方法均已在水稻转基因研究成功应用。但由于PEG介导法及电击法，需要借助于植物原生质体培养技术，难度较大，并且植物原生质体可能受激素作用或自发融合的影响，产生细胞变异。基因枪法，虽然操作简单，但是经济耗费大，且存在外源基因容易丢失，容易基因沉默，转基因后代易突变等缺点。目前，通过农杆菌侵染水稻愈伤组织获得转基因水稻是目前研究最深入、最成熟的遗传转化方法，且其拥有转化频率高、多拷贝频率低、成本低等优点而被广泛采用。但是，该方法受到植物组织培养技术的影响，组织培养过程中通常采用成熟种子或幼胚诱导愈伤组织诱导率、低继代培养效率都限制了转基因植株的获得。建立一个不依赖植物组织培养技术的水稻遗传转化方法具有重大意义。

农杆菌是一种土壤中广泛存在的革兰氏阴性菌。植物受到损伤后，会产生一些酚类物质，进入农杆菌细胞内，引起T-DNA的加工，进入植物细胞并整合到细胞核基因组上。如果将目的基因插入合适构建的农杆菌T-DNA中，外源基因就会随着T-DNA而插入植物基因组中，并随着植物细胞的分裂分化，产生转基因植株。农杆菌介导的水稻遗传转化研究所采用的受体材料主要有：幼穗、幼胚、成熟胚、花药愈伤组织、茎尖分生组织等。上述材料来源植物的不同发育阶段，具有时空差异性。作为理想的遗传转化材料，应具有以下优点：第一，材料相对均一，重复性与普遍性高。第二，材料相对较大，便于获得及遗传转化处理。第三，材料容易保存，减少季节对取材的影响，便于进行实验。第四，材料分化程度低，细胞全能性强，是材料遗传转化成功，发育成完整植株的根本保障。由于水稻成熟种子个体较大，材料均一，重复性好，并且易获得，易保存，细胞全能性强，所以是做水稻遗传转化研究的理想材料。同时，水稻遗传转化往往需要借助植物组织培养，而其中外植体的消毒是关键因素之一，消毒时间过短，组织培养过程容易染菌；时间过长，消毒物质会杀伤植物细胞，影响组培效果。由于基因型的差异，不同水稻品种的遗传转化效率不同。就目前报道来看，关于粳稻的遗传转化成功的案例报道很多，但是对于籼稻来讲，成功的案例很少。受籼稻基因型的影响，T-DNA插入籼稻基因组的效率比粳稻低。虽然包括Hiei在内的许多人都提出了对籼稻进行农杆菌介导的遗传转化的优化，但是只有相当少的籼稻品种转化成功，很大程度是受材料本身基因型的限制。所以，建立一个高效的转化受体基因型依赖程度低的水稻遗传转化方法具有重大意义。

发明内容

针对上述领域中的需求，本发明提供一种遗传转化方法，避免了传统的水稻遗传转化必须依赖的植物组织培养中技术繁琐，严格的消毒与无菌条件，培养周期长，经济投入多，并且对材料的状态和基因型要求高，不同的材料往往需要摸索不同的组培条件，甚至得不到理想的效果等一系列缺陷，建立一种高效快速的农杆菌介导的水稻茎尖遗传转化方法。

一种快速高效的农杆菌介导的水稻茎尖遗传转化方法，包括以下顺序步骤：

(1)取水稻成熟种子萌发，得到其发芽期个体；

(2)以发芽期的水稻个体为材料，横切其胚芽，将包括裸露茎尖分生组织作为遗传转化受体；

(3)以农杆菌为介导，通过真空渗透处理，将农杆菌导入茎尖分生组织细胞，使其携带目的基因的T-DNA插入植物基因组；

(4)待转化后植株长出3-4片新叶后，筛选鉴定转基因植株。

所述种子萌发为水稻种子无需消毒处理，直接以自来水42℃浸泡露白后，37℃催芽24h。

所述茎尖分生组织是带有完整胚根、胚乳且切除胚芽后的茎尖分生组织。

所述步骤(3)真空渗透处理方法为将暴露出茎尖分生组织的水稻个体用AAM重悬菌液浸泡，抽真空处理。