[发明专利]人工多抗原融合蛋白及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及医药领域，更具体地涉及能同时刺激CD4⁺和CD8⁺T细胞免疫应答的人工多抗原融合蛋白及其制法和应用。本发明的人工多抗原融合蛋白，经表达纯化后可直接用于免疫诊断或者用作预防性或治疗性疫苗。

背景技术

人体感染细菌病毒或者受到癌细胞刺激后会产生一系列体液免疫和细胞免疫变化。细胞免疫对肿瘤细胞和已感染入细胞内的细菌及病毒非常重要。人体初次受到上述外源刺激后，会使T淋巴细胞致敏，转化为记忆T淋巴细胞。当人体再次接触同一种抗原后，会迅速产生特异性免疫反应，包括效应T淋巴细胞反应，产生多种细胞因子发挥免疫学效应(细胞免疫)。由于细胞免疫在控制和清除细菌、病毒及肿瘤中起着不可忽视的作用，因此细胞免疫的疫苗对预防细菌病毒感染和肿瘤治疗有一定作用。

目前临床上对于肿瘤及一些细胞内感染的细菌及病毒，尚无有效的化学药物。因此，刺激细胞免疫的治疗性疫苗对控制肿瘤及细菌病毒感染起着非常重要的作用。目前，美国FDA已经批准治疗前列腺癌的治疗疫苗上市。

另外对细胞免疫的监测对于疾病的治疗、预后以及评价疫苗的有效性至关重要。

常用的检测细胞免疫的方法是酶联免疫斑点法(enzymelinkedimmunospotassay，ELISPOT)，该方法可以从单细胞水平检测分泌细胞因子的T细胞。例如，可以通过检测结核(TB)特异性抗原剌激后分泌细胞因子的T细胞数量，来评价细胞免疫功能。对结核来说，检测细胞免疫是诊断是否感染TB的方法之一。2008年美国FDA己批准ELISPOT商品化试剂盒T-SPOT用于结核感染的诊断。这些诊断试剂盒基本都是使用18-20个氨基酸的多肽混合物作为刺激源。这些多肽被外周血的抗原递呈细胞吞噬后，加工递呈后与自身HLA抗原一起到细胞表面，然后被记忆T淋巴细胞的T细胞受体识别。T细胞被刺激后，产生以伽马干扰素为代表的细胞因子而被检测到。

人体内有许多不同克隆的T细胞，每个克隆都需要被不同的短肽加HLA刺激；不同人体也有不同的T细胞克隆，不同人体的HLA抗原也不同。如要选择某个HLA人群的T细胞，就要鉴定、选择该类人群的T细胞表位抗原。鉴定HLA表型及鉴定T细胞表位序列都是费时费力的工作。如要覆盖所有人群及某个刺激源(蛋白质)的所有T细胞识别表位最常见的方法就是合成长度18-20个氨基酸，甚至更长的多肽。然而要在临床上使用，每种多肽都需要建立严格的生产工艺和质量检测标准。以用于TB检测的ESAT6(96个氨基酸)和CFP10(100个氨基酸)为例，通常需要20个以上的多肽混合物才能覆盖两个蛋白抗原的全部表位，导致成本很高，试剂盒价格昂贵，因而在一定程度上限制了其广泛应用。一种替代方案是选择有限的几个多肽作为刺激源，但由于不同人群的HLA多态性，T细胞识别的抗原表位有差异，因此这种方案尽管节约成本但是也降低了表位的覆盖率。

预防与治疗性疫苗被送到抗原递呈细胞尤其树突状细胞(DC)处理提呈后，能刺激和促使抗原特异性的细胞毒CD8⁺(CTL)和辅助性CD4⁺T淋巴细胞。辅助性CD4⁺T细胞能够有效刺激和放大细胞毒CD8⁺T细胞及帮助B细胞产生抗体。CD8⁺T细胞能特异识别并溶解含靶抗原的靶细胞。特异性CD8⁺T细胞的激活依赖于抗原能被有效递呈到MHC-I类分子(在人类即HLA-I类抗原)。CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞由于能够直接识别和破坏肿瘤细胞或者病毒等感染的细胞，是预防及治疗性细胞免疫疫苗的主要有效成分。因此，目前绝大多数治疗性疫苗的设计都围绕在如何刺激机体产生特异性的识别肿瘤或者病毒抗原CD8⁺T细胞。

目前主流的观点是只有在抗原呈递细胞(APC)浆内的抗原才能被蛋白酶体降解成小分子肽，通过TAP蛋白运输进入内质网，其中CTL表位多肽与MHC-I(HLA-I)类结合并呈送到抗原递呈细胞表面，与CD8⁺T细胞的特异性受体结合后，特异性激活后者。同时传统观点还认为，只有在细胞浆内转录翻译后产生的蛋白抗原才能进入MHC-I(HLA-I)的提呈途径。这也是目前治疗性疫苗的核心设计策略，即开发能在细胞浆内复制转录翻译的疫苗。如果一个蛋白质抗原是被细胞吞噬进来的，那么这个抗原就不会进入细胞浆，而是进入内吞体及溶酶体，因此这个蛋白质抗原就无法有效刺激CD8⁺T细胞。