[发明专利]一种提高AA-2G转化率的环糊精葡萄糖基转移酶突变体

说明书

技术领域

本发明涉及一种提高AA-2G转化率的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

维生素C(VC)是一种人体自身不能合成的水溶性维生素，参与体内很多的生理活动，如促进胆固醇转变为胆汁酸，促进肾上腺皮质激素的合成，参与芳香氨基酸的代谢，促进铁的吸收及参与体内多种氧化还原反应，在维持和促进人体健康中扮演着重要的角色。另外，维生素C还能促进胶原蛋白的合成，还原已形成的黑素，对保持皮肤弹性、美白、除皱有一定的作用。广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。但是VC二位碳的羟基极不稳定，非常容易氧化降解而限制了其应用。2-O-α-D-吡喃葡萄糖基抗坏血酸(AA-2G)是一种维生素C的糖类衍生物，是最稳定、性能最佳的VC替代品，近些年主要作为一种美白添加剂应用于多种品牌的高端化妆品中。

目前，全世界应用于化妆品中的AA-2G均由日本林原公司一家提供，其在市场上占有垄断的地位。AA-2G的价格约为3000元/kg，大概是维生素C的100多倍，可见其市场价值。我国是维生素C生产大国，国内VC生产企业拥有超过全球80％产能，然而我国VC产品四分之三用于出口，内销部分主要用于医药，品种较单调。我国对AA-2G的研究也有报道，但仅属于初步的探索阶段，尚未达到工业化水平。因此挖掘优化适合生产AA-2G的糖基转移酶对于推动我国AA-2G的工业化具有十分重要的意义。

本发明所使用的来源于Bacillus stearothermophilus NO2环糊精葡萄糖基转移酶CGTase虽然在转化过程中能够实现AA-2G的生产，但其后提取工艺仍不可缺少。如何提高底物转化率，节约成本，简化后提取工艺将成为环糊精葡萄糖基转移酶的研究方向。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，包括含有一个或两个相对于Bacillus stearothermophilus NO2环糊精葡萄糖基转移酶活性氨基酸残基的取代，与亲本相比有更高的AA-2G转化效率。

所述环糊精葡萄糖基转移酶的亲本基因与NCBI数据库中的Bacillus stearothermophilus NO2环糊精葡萄糖基转移酶一致(登录号X59042.1)。

所述环糊精葡萄糖基转移酶的亲本基因编码的成熟蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。

所述突变体相对于氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶发生了一个或两个氨基酸位点的突变。

所述突变与CGTase产AA-2G的转化率相关。

所述发生突变的氨基酸位点是第228位的赖氨酸或第367位的天冬氨酸。

所述突变体是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中第228位的赖氨酸(Lys)突变为精氨酸(Arg)，命名为K228R，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述突变体是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中第367位的天冬氨酸(Asp)突变成丝氨酸(Ser)，命名为D367S所示。

所述突变体是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的第228位的赖氨酸(Lys)突变为精氨酸(Arg)，同时将第367位的天冬氨酸(Asp)突变成丝氨酸(Ser)，得到的突变体命名为K228R/D367S。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体的制备方法，包括如下步骤：

(1)在Bacillus stearothermophilus NO2环糊精葡萄糖基转移酶氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带环糊精葡萄糖基转移酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含突变体的质粒载体；

(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；

(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，并纯化环糊精葡萄糖基转移酶突变体K228R、D367S、D367S/K228R。

所述质粒载体为pUC系列，pET系列，或pGEX中的任意一种。

所述宿主细胞为细菌和真菌细胞，其也为本发明的保护范围。

所述的细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。