[发明专利]目标区域测序文库构建方法

权利要求书

1.一种构建目标区域测序文库的方法，其特征在于，包括：

(a)获取待测样本中的核酸，所述核酸由多个核酸片段组成，所述核酸片段来自断裂的基因组DNA和/或游离的DNA；

(b)末端修复所述核酸片段，获得末端修复片段；

(c)加碱基A至所述末端修复片段的两端，获得粘性末端片段；

(d)连接接头于所述粘性末端片段的两端，获得接头连接片段；

(e)对所述接头连接片段进行第一扩增，获得第一扩增产物；

(f)利用试剂盒对所述第一扩增产物进行捕获，获得所述目标区域；以及，

(g)对所述目标区域进行第二扩增，获得第二扩增产物，所述第二扩增产物构成所述目标区域测序文库；其中，

所述试剂盒包含探针，所述探针能够特异性识别表1中基因的预定区域，

表1

其中，所述探针的获得包括，获得初始探针集以及筛选所述初始探针集；

所述获得初始探针集包括：

确定所述基因区域在参考基因组上的位置，获取所述基因区域的参考序列，

从所述基因区域参考序列一端的第一个核苷酸开始拷贝所述参考序列获取第一条DNA片段，

从所述基因区域参考序列一端的第二个核苷酸开始拷贝所述参考序列获取第二条DNA片段，

从所述基因区域参考序列一端的第三个核苷酸开始拷贝所述参考序列获取第三条DNA片段，

这样依次获取后续DNA片段直至第N条DNA片段的一端超出所述基因区域参考序列的另一端，其中，

一条DNA片段为一条初始探针，全部所述DNA片段构成所述初始探针集，N为所述初始探针集中包含的初始探针的总数；

所述筛选初始探针集包括：

将所述DNA片段与所述参考序列比对，获得每一条DNA片段在参考序列上的比对次数，过滤掉比对次数超过1的DNA片段；

所述筛选初始探针集还包括，去除掉GC含量不在35-70％的DNA片段。

2.权利要求1的方法，其特征在于，所述探针的长度为25-300nt。

3.一种测序方法，其特征在于，包括：

根据权利要求1或2任一方法构建目标区域测序文库；

对所述目标区域测序文库进行测序，获得测序数据，所述测序数据由多个读段组成。

4.权利要求3的测序方法，其特征在于，所述测序为双末端测序，所述测序数据由多对读段对组成。

5.一种检测目标区域变异的方法，所述方法用于非疾病诊断目的，其特征在于，包括，

(1)利用权利要求3或4的方法，获得测序数据；

(2)基于所述测序数据，检测所述目标区域变异，获得变异位点信息，所述变异包括SNV、InDel、SV和CNV至少之一。

6.权利要求5的方法，其特征在于，步骤(2)包括，

将所述测序数据与参考序列进行第一比对，获得第一比对结果；

将所述第一比对结果与所述参考序列的一部分进行第二比对，获得第二比对结果；

基于所述第一比对结果和所述第二比对结果，同时检测所述目标区域中的SNP、InDel、SV和CNV变异中的至少两种；其中，

所述参考序列的一部分包括目标区域参考序列中的每个已知InDel位点，以及所述每个已知InDel位点上下游各1000bp的参考序列。

7.权利要求6的方法，其特征在于，在所述第一比对之前，对所述测序数据进行过滤，所述过滤包括去除掉不确定碱基比例超过10％的读段和/或碱基质量值不大于5的碱基数的比例不小于50％的读段。

8.权利要求6或7任一方法，其特征在于，在所述第二比对之前，去除掉第一比对结果中的一个读段对中的两个读段相同的读段对。

9.权利要求6或7任一方法，其特征在于，所述参考序列为HG19。