[发明专利]一种组织修复材料的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于组织工程学医用生物材料技术领域，具体涉及一种组织修复材料的制备方法。

背景技术

组织、器官的丧失或功能障碍是人类健康所面对最频繁、最严重的问题之一。据统计，在美国每年有上百万人患有各种组织、器官丧失或功能障碍，每年需要进行手术800万次，年耗资逾400亿美元。近年来，随着组织工程与再生医学的发展，组织、器官的修复治疗有了许多突破，其中异种脱细胞生物膜材料因其独特的天然结构、与组织再生同步的降解性能获得了更多关注。国内外很多研究机构和公司对异种脱细胞生物膜材料进行了多年的基础研究和应用研究，其多年的临床应用也显示了材料安全有效。

在异种材料来源方面，研究较多的包括真皮、小肠粘膜下层、膀胱、腹膜、筋膜、心包膜、心脏瓣膜等。因异种材料本身含有大量细胞、遗传物质、脂肪，直接应用于人体会引发强烈的免疫反应，所以需要经过脱脂、脱细胞、去抗原等处理，最大限度地保留细胞外基质成分，实现其引导组织再生和修复的功能。因此，材料的处理过程对其使用效果具有重要作用。

脱细胞方法包括物理、化学和生物学方法。其中物理方法采用冻融、压力，能够杀死细胞却不能将细胞成分和遗传物质转运出来。化学方法包括1）酸碱法，酸或碱的处理可以导致细胞裂解，引起或催化活性分子的水解降解，达到脱细胞的目的，但酸或碱的长时间作用会对材料产生严重破坏；2）采用高低渗溶液，利用渗透压原理破碎细胞进行脱细胞的方法，被认为是对基质的分子结构破坏最小的脱细胞方法，但其单独作用的效果不彻底，处理后有少量的细胞碎片和DNA残留；3）采用去污剂脱细胞的方法，包括离子型去污剂（如SDS）和非离子型去污剂（如TritonX-100），以及两性离子型去污剂（如CHAPS），去污剂能够溶解细胞膜，将DNA洗脱出来，但去污剂同时破坏和分解了材料中的蛋白质，同时不易清洗，一方面增加成本、造成生产周期过长，另一方面试剂残留会影响材料的安全性和相容性；4）采用有机试剂脱细胞的方法，包括醇类和酮类等的应用。生物学方法主要包括酶和螯合物的应用，其存在破坏材料结构和试剂残留较难清洗的问题。

实践证明，上述方法的单独使用均无法达到理想的脱细胞效果，因此通常选择两种或几种方法联用或混合使用。美国专利US6206931以过氧乙酸-乙醇-水溶液共同作用对猪小肠粘膜下层进行脱细胞处理，对材料的结构影响较小；而本发明人按该文献记载实验，证明采用该方法处理后仍能观察到完整细胞结构的存在，这将会产生潜在的免疫排斥反应和炎症反应风险。美国专利US5387278利用先碱后酸处理，可以达到脱细胞效果，这两种强烈的脱细胞方法长时间的叠加使用，会对材料结构造成不可逆转的破坏，导致材料降解过快、力学性能低，不能达到与组织再生的同步降解，无法应用于临床；此外，该方法在脱细胞之后采用丙酮脱脂、有机试剂脱水干燥，存在有机试剂残留的风险；所以，该方法从工艺放大的可行性和科学性上仍有改进空间。美国TUTOGEN公司的系列产品采用过氧化氢进行脱细胞处理，处理过程会产生大量泡沫，不易于清洗，容易造成试剂残留影响材料的安全性。美国专利US5413798是以稀碱、稀氯化钠、络合剂进行脱细胞，也存在试剂残留的风险，在体内能引起较强的毒性反应。

临床研究发现，在一些外科手术中，当材料厚度较薄，不能充分填充损伤部位高度时，会造成修复部位凹陷或表面凹凸不平，严重影响其修复效果与功能恢复。此外，在临床使用过程中，较薄的材料因复水或吸附组织液后容易皱缩，粘附在手术器材上，给手术操作造成不便。而生物材料的厚度受原材料本身的限制，如心包膜、腹膜、膀胱膜等材料厚度仅为0.1~0.4mm；为弥补此缺陷，一般采用生物材料叠加或复合其他材料的方式增加厚度，这样不可避免地造成成本增加和产量下降，还带来使用过程中出现材料分层的风险，影响组织的恢复效果。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种组织修复材料的制备方法，使所得的组织修复材料脱细胞彻底、无完整细胞结构和细胞碎片的残留、DNA残留和试剂残留风险低，厚度增加2~4倍，具有较好的力学性能和抗降解性，可以满足临床应用的要求。

本发明提出的组织修复材料的制备方法，包括前处理、脱脂、病毒灭活、脱细胞、材料发胀、冻干和灭菌的步骤，具体包括：

步骤一、前处理：将哺乳动物来源的膜组织平铺于平板，去除附着脂肪、结缔组织及边缘破损组织，之后水洗至无血色，得到生物膜材料；所述的哺乳动物包括猪、牛、羊的任一种；所述的膜组织包括膀胱基质膜、腹膜、筋膜、心包膜、心脏瓣膜中的任一种；