[发明专利]一种快速测定食物中毒样品中的酵米面黄杆菌毒素A的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速测定食物中毒样品中的酵米面黄杆菌毒素A的方法。属于食品安全生物毒素检测技术领域。

背景技术

酵米面黄杆菌是从引起食物中毒的酵米面中分离出来的一种细菌。目前认为该菌是引起食物中毒细菌中死亡率较高的一种。流行病学调查，我国近年在广西、云南、湖北、广东、四川、河北、江苏等省发生多起酵米面食物中毒事件。山东、河南、河北等省因进食变质银耳也发生同类中毒。中毒多发生在农村，特别是山区、半山区，城镇偶见。引起中毒的主要食品是酵米面(玉米加水浸泡10～30天,用水洗,磨浆过滤,沉淀晾干成粉,加工后做成的食品)和变质的银耳。中毒发病急、病情严重、发展迅速，病死率高达30～90％，至今尚无特效的治疗方法。

目前检测酵米面黄杆菌毒素A(米酵菌酸)的国家标准检测方法仅有GB/T 5009.189-2003银耳中米酵菌酸的测定中规定的薄层色谱法和高效液相色谱法，但该方法，仅能检测银耳中的黄杆菌毒素A(米酵菌酸)，且样品提取复杂，耗时长，检测灵敏度低，无法准确定性等问题。

发明内容

本发明提供了一种快速测定食物中毒样品中的酵米面黄杆菌毒素A的方法。

本发明采用如下技术方案：

本发明的快速测定食物中毒样品中的酵米面黄杆菌毒素A的方法包括步骤如下：

(1)样品提取步骤；

(2)酵米面黄杆菌毒素A的分子离子峰、特征子离子峰及MAM参数的确定；

(3)样品定性定量检测。

所述样品提取具体步骤如下：

(1)不含油样品：

准确称取2.000g食物，加10ml纯水匀浆，用6mol/L HCL调至pH2～3，8000r/min离心10min，取上清液，加正己烷提取两次，每次10ml，合并正己烷，40℃旋转蒸发至干，用甲醇定容至1ml，待测；

(2)含油样品：

准确称取2.000g食物，加10ml 40g/L碳酸氢钠匀浆，8000r/min离心10min，取上清液，加石油醚10ml提取，弃去石油醚，用6mol/LHCL调至pH2～3，加正己烷提取两次，每次10ml，合并正己烷，40℃旋转蒸发至干，用甲醇定容至1ml，待测；

所述确定酵米面黄杆菌毒素A分子离子峰、特征子离子峰及

MAM参数具体的步骤如下：

(1)把酵米面黄杆菌毒素A的标准品，配置成1mg/kg的浓度，通过蠕动泵注入串联质谱仪，找到酵米面黄杆菌毒素A分子离子峰(母离子，M-1离子)为485.4、

(2)通过调节串联质谱仪的碰撞气能量(CE)和去簇电压(DP)撞击酵米面黄杆菌毒素A分子离子峰(母离子，M-1离子)485.4，找到三个有代表性特征子离子，分别为441.4、397.3、321.5。

(3)通过串联质谱仪把碰撞气能量(CE)和去簇电压(DP)调节到最佳状态。选择测定酵米面黄杆菌毒素A的离子对、碰撞电压和去簇电压详见表1。

表1酵米面黄杆菌毒素MRM监测参数

所述样品检测具体步骤如下：

(1)对步骤2处理后的样品使用超高效液相色谱和在ESI负离子模式下用串联四极杆质谱进行定性定量分析；

①色谱条件为：Waters BEH HILIC 1.7μm 2.1×100mm色谱柱及同种填料不同柱形的色谱柱；进样量5～20μl；柱温为30℃；流动相A为水，其中含有0.1％甲酸：B为甲醇，流动相比率A:B＝30％:70％，等梯度洗脱3min，流速300μl/min；

②质谱条件为：离子化方式：电喷雾离子源负离子模式；检测方式：MRM；碰撞气：Midium；气帘气：25psi；雾化气：45psi；加热气：55psi；喷雾电压：-4500V；去溶剂温度：400℃；扫描时间:20ms。

(2)样品的定性测定：对酵米面黄杆菌毒素A标准品及对步骤2处理后的样品溶液按照上述UPLC/MS/MS测定条件分别进行测定，如果进行样品测定时，检出的色谱峰的保留时间与标准样品相一致，并3个二级特征子离子均出现，且与标准样品的3个特征离子相一致，则可判断样品中存在酵米面黄杆菌毒素A。