[发明专利]一种检测淀粉样多肽聚集及其聚集抑制剂评估的方法

说明书

技术领域

   本发明涉及淀粉样多肽，特指一种检测淀粉样多肽聚集及其聚集抑制剂评估的方法。

背景技术

 目前已知蛋白质及多肽的异常集聚和40多种疾病相关，如神经退行性疾病阿尔茨海默氏病和帕金森综合症等；淀粉样蛋白质（多肽）的寡聚体及其集聚所形成的斑块被认为是这些疾病的主要病因之一；基础医学以淀粉样蛋白为靶点开始进行研究，发展药物减少淀粉样多肽的产生和降低淀粉样多肽的集聚及毒性；目前在科研和医药产业中，针对疾病的相关靶多肽和蛋白的特效药物开发是十分重要的研究领域，具有极其重要的研究价值和经济价值。

医药学关于药物研发的严肃性要求新发现的抑制剂在进入临床使用前需要进行严格的使用效果及安全性的评价，主要是基于生物细胞毒理性实验和动物模型实验，这些评价流程非常严格和繁琐复杂；阿尔茨海默氏病的药物研究通常需要培养大批量细胞供实验使用并建立特殊的动物模型，例如人神经细胞瘤细胞系 SK-N-SH 和通过分子生物学方式诱导产生淀粉样多肽在动物脑内来构建阿尔茨海默氏病的动物模型，而实验结果读取需要使用酶联免疫吸附测定法和蛋白质印迹法获得，虽然实验结果相对可靠，但实验周期很长而且成本很高，很大程度上减缓了对原有的和新开发的抑制剂筛选和评价进程；由于生物体内影响因素很多，即使细胞和动物实验筛选到有效果的抑制剂，也难以最终确定抑制剂的作用机制；相比之下，将候选药物在体外进行初步筛选和评价，可以节约大量的时间和资源。由于淀粉样多肽的聚集与其毒性密切相关，所以可以通过检测淀粉样多肽的聚集，以及设计分子抑制淀粉样多肽聚集来初步评价淀粉样多肽以及其聚集抑制剂效果；目前，多肽聚集抑制剂的体外筛选已经取得了一些研究进展，如2006年基于绿色荧光融合蛋白技术，Kim 等人通过荧光分析技术筛选了三嗪类衍生物化合物分子库，发现了新的抑制剂分子；2011年Mook-Jung研究组利用金纳米粒子开展了淀粉样多肽聚集抑制剂的筛选和评价工作，取得了一定的成果； 在2013年，国内的周飞艨课题组研究利用二茂铁标记的荧光淀粉样多肽结合高效液相色谱（HPLC）筛选淀粉样多肽的聚集抑制剂；但目前已知在体外筛选多肽聚集抑制剂的各种方法中，大多采取荧光探针技术，是否可以开发一种免标记方法，测定淀粉样多肽聚集状态，并对其相关的聚集抑制剂进行筛选评价，是研究者一直关注的问题。

石英晶体微天平(quartz crystal microbalance，QCM)是一种非常灵敏的质量检测仪器，理论上可以检测到相当于单分子层或原子层的几分之一的质量变化；在科学研究上，QCM早期主要用于检测真空和气态环境下的表面质量变化，而现在已逐渐扩展到液态环境下检测，尤其是在生物学检测领域，国内的QCM研究发展十分迅速；计剑、刘光明等人和杜滨阳研究组分别利用QCM研究表面多层膜的组装制备和高分子薄膜；马宏伟研究组应用QCM研究了茎环ssDNA开环和嗜酸性古生菌细胞膜耐酸的机理等；张广照课题组利用QCM 研究磷脂膜表面和疏水基团的相互作用和温敏高分子刷。

由于石英晶体微天平对于表面质量增加非常灵敏，可以用来研究淀粉样多肽在表面上的实时生长和集聚行为，无需荧光标记，这和传统的方法相比具有优势：传统方法硫磺素染色（Thioflavin T binding，ThT）通常需要几个小时甚至更长时间才能测定多肽的集聚行为，QCM 方法在数分钟内就能得到结果，同时 QCM 作为一种无标记方法也能避免如荧光检测法带来的繁琐操作和毒性；基于 QCM 可以开展较大规模的多肽相关药物评价和筛选，为药物的细胞及动物实验创造较好基础，大大加快相关药物的研发。

QCM检测液相条件固体表面质量的变化

石英晶体微天平（Quartz crystal microbalance，QCM）是一种利用石英晶体压电效应检测表面质量变化的仪器；当外部施加一个电场时，晶体会产生机械振动，当石英晶体的厚度为电极的机械振荡波半波长奇数倍时就会发生共振，关于真空中其共振频率变化（ ）与面均质量变化的关系由Sauerbrey方程可以得到。

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