[发明专利]一种鸭瘟病毒基因缺失转移载体及其应用

权利要求书

1.一种鸭瘟病毒基因缺失转移载体，其特征在于，所述的转移载体是由如下步骤构建：

1)以鸭瘟病毒为模板，利用序列为SEQ ID NO:1和序列为SEQ ID NO:2的引物对进行PCR扩增，回收扩增片段，并连接入载体构成质粒pMD-gI-L；

用序列为SEQ ID NO:3和序列为SEQ ID NO:4的引物对进行PCR扩增，回收扩增片段，并连接入载体构成质粒pMD-gE-R；

2)将pMD-gI-L用Bgl II与BamH I进行双酶切，回收纯化片段克隆至已用Bgl II限制性内切酶进行酶切并回收的pLS-lacZ载体上，正向连接构建成pgI-lacZ质粒；应用限制性内切酶Xho I与Pst I分别对质粒pgI-lacZ和pMD-gE-R进行双酶切，回收纯化片段进行连接，制成鸭瘟病毒基因缺失转移载体pgIE-lacZ。

2.如权利要求1所述的转移载体，其特征在于，所述的pLS-lacZ载体的构建方法如下：

1)Loxp序列设计与合成：

将两端分别带有Nde I与Hind III酶切位点，含两个同向的34bp的Loxp序列的核苷酸片段和质粒pUC57用Nde I与Hind III分别进行酶切，酶切片段连接获得质粒pUC-LS；所述的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO:5；

2)SV40启动子及lacZ基因获得

以pCDNA3.1(+)为模板，序列为SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7的引物对扩增得到片段，应用Bgl II及Xho I双酶切回收后连接到pUC-LS相应的BamH I与Sal I位点内，构建质粒pLS-neo；以序列为SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9的引物对扩增lacZ基因，应用Sma I及BstX I进行双酶切后连接到pLS-neo对应的酶切位点，构建得到pLS-lacZ质粒。

3.权利要求1所述的鸭瘟病毒基因缺失转移载体在制备重组鸭瘟病毒株中的应用。

4.一种重组鸭瘟病毒株，其特征在于，所述的重组鸭瘟病毒株的制备方法如下：

1)用鸭瘟病毒感染鸡胚成纤维(CEF)细胞；

2)用权利要求1所述的重组转移载体质粒转染已感染鸭瘟病毒的CEF细胞；

3)待细胞出现明显病变后收获转染的细胞，反复冻融后将经转染的病毒按一定的稀释倍数接种CEF细胞；

4)在X-gal存在条件下进行蓝斑筛选，在出现蓝斑的细胞中覆盖低溶点营养琼脂；

5)挑取出含蓝斑的细胞毒进行冻融；

6)将冻融的筛选的蓝斑细胞毒接种CEF细胞，并覆盖低溶点营养琼脂；

7)重复上述步骤5)和6)直至获得纯化的含lacZ基因的重组鸭瘟病毒。

5.权利要求4所述的重组鸭瘟病毒株在制备去除lacZ基因的重组鸭瘟病毒株中的应用。

6.一种去除lacZ基因的重组鸭瘟病毒，其特征在于，所述的重组鸭瘟病毒株的制备方法如下：

1)权利要求4所述的重组鸭瘟病毒株感染CEF细胞；

2)表达Cre蛋白酶的质粒pBS185转染已感染权利要求4所述的重组鸭瘟病毒株的CEF细胞；

3)待细胞出现明显病变后，收获转染细胞，反复冻融后按一定稀释倍数接种CEF细胞；

4)在X-gal条件下进行蓝斑筛选，在出现蓝斑的细胞中覆盖低溶点营养琼脂，注意观察挑取未呈现蓝色的病毒感染蚀斑细胞；

5)反复冻融挑取的非蓝色的病毒感染蚀斑细胞；

6)将反复冻融的筛选的蚀斑细胞接种CEF细胞，在X-gal条件下后覆盖低溶点营养琼脂；

7)重复上述步骤5)和6)直至获得纯化的去除lacZ基因的重组鸭瘟病毒rDPV/gI^-/gE^-。

7.权利要求4所述的重组鸭瘟病毒株在制备疫苗中的应用。

8.权利要求6所述的重组鸭瘟病毒株在制备疫苗中的应用。