[发明专利]一种鸭瘟病毒基因缺失转移载体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和动物病毒学技术领域，具体涉及一种鸭瘟病毒基因缺失转移载体及其应用。

背景技术

鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)是目前严重威胁我国养鸭业的主要病毒之一。2013年国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)对鸭瘟病毒重新进行了分类，归属为疱疹病毒目(Herpesvirales)疱疹病毒科(Herpesvirales)α-疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)马立克病毒属(Mardivirus)(http://ictvonline.org/virusTaxonomy.asp)分类学名称为“Anatid herpesviurs 1(AnHV-1,鸭疱疹病毒1型)。鸭瘟病毒是一种泛嗜性全身性感染病毒，主要引起鸭、鹅、天鹅等雁形目水禽的急性接触性传染病。在自然条件下引起鸭只大批发病和死亡。不同年龄、性别的鸭均易感，自然感染主要见于成年鸭，尤其是母鸭，但不同品种的鸭易感性不同。鸭瘟感染后典型病理变化以血管损伤、组织出血、消化道粘膜糜烂、淋巴器官病变、实质器官退行性病变为特征，是影响我国水禽养殖业的重要疫病。(Saif Y M.禽病学(第11版).高福,苏敬良译.北京:中国农业出版社,2005：389-398)。由于鸭瘟引起鸭肠炎的典型特征，该病又被称为鸭病毒性肠炎(Duck virus enteritis,DVE),鸭瘟病毒又称为鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV) 

目前对鸭瘟疾病的预防主要依靠接种灭活疫苗和鸡胚化弱毒疫苗来预防鸭瘟的发生。灭活疫苗虽然安全性好，但免疫维持期短、剂量较大、成本较高；鸡胚化弱毒疫苗虽然免疫效果较好，但存在毒力返强和隐性带毒等安全隐患，而且现有的诊断方法无法区别自然感染野毒和弱毒疫苗免疫的动物。因此，研制更为安全有效的新型基因工程疫苗，尤其是标记疫苗具有重要的理论和应用价值。

发明内容

本发明目的在于提供一种鸭瘟病毒基因缺失转移载体及其应用，该转移载体通过与鸭瘟病毒发生同源重组，从而获得鸭瘟病毒基因缺失工程毒株，利用该毒株可制备一种安全性高、防制效果好的鸭瘟病毒基因缺失疫苗。

本发明首先提供一种鸭瘟病毒基因缺失转移载体，为pgIE-lacZ，该重组转移载体由如下步骤构建的：

1)以鸭瘟病毒为模板，利用序列为SEQ ID NO:1(上游引物：5′- GAAGATCTGCCGGACCCGACCACCAG-3′)和序列为SEQ ID NO:2

(下游引物：5′-CGGGATCCAATTCCAAGACGAGGGCAATCATCAT-3′)的引物对进行PCR扩增，回收扩增片段，并连接入载体构建质粒pMD-gI-L；

用序列为SEQ ID NO:3(上游引物：5′-CCGCTCGAGACCGTGTTTATTTCATCCGTCTG-3′

)和序列为SEQ ID NO:4(5′-CCCTGCAGAGCGCGTATTAACCTTTTGTAGC-3′)的引物对进行PCR扩增，回收扩增片段，并连接入载体构建质粒pMD-gE-R；

2)将pMD-gI-L用Bgl II与BamH I进行双酶切，回收纯化片段克隆至已用Bgl II限制性内切酶进行酶切并回收的pLS-lacZ载体上，构建成pgI-lacZ质粒；应用限制性内切酶Xho I与Pst I分别对质粒pgI-lacZ和pMD-gE-R进行双酶切，回收纯化片段进行连接，制成鸭瘟病毒基因缺失重组转移载体pgIE-lacZ。

上述的pLS-lacZ载体的构建方法如下：

1)Loxp序列设计与合成：

将两端分别带有Nde I与Hind III酶切位点，含两个同向的34bp的Loxp序列的核苷酸片段(SEQ ID NO:5：

CATATGAGATCTGAATTCTCGCGAATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGGATCCGAGCTCGCTAGCGGTACCTCTAGATATCGTCGACATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCTCGAGCTGCAGAAGCTT)和质粒pUC57用Nde I与Hind III分别进行酶切，酶切片段连接获得质粒pUC-LS；

2)SV40启动子及lacZ基因获得