[发明专利]体外软骨细胞的培养方法

说明书

技术领域

本发明属于体外组织细胞定向培养技术领域，具体涉及一种体外软骨细胞的培养方法。

背景技术

在机体中，软骨细胞是关节软骨中唯一的细胞类型，其主要功能是通过分泌II型胶原(type II collagen)及蛋白多糖(aggrecan，Acan)等保持关节软骨的功能。在正常生理条件下，软骨细胞的合成和分解代谢维持着动态平衡；而发生软骨缺损和骨关节炎(OA)时，关节软骨组织受到多种因子的作用，关节软骨损伤和修复之间的稳态被破坏，软骨的分解代谢明显大于合成代谢，表现为二型胶原和蛋白多糖的降解大于合成，其中二型胶原通常被基质金属蛋白酶(MMPs)所降解，而蛋白多糖则由ADAMTS家族所降解。

对于软骨缺损的治疗方法中，现有较为理想的是采用自体软骨细胞移植(ACI)以及基质介导的自体软骨细胞移植术(MACI)，将选自体内的正常软骨细胞在体外进行定向(细胞)培养后，再移植至机体内的软骨损伤处。而其中的难点在于，软骨细胞的体外培养过程中，由于失去了机体内特定的增殖环境以及本身细胞的全能性因素，所以软骨细胞体外培养增殖速度较慢以及伴随着退变现象，如二型胶原COLII表达下降、一型胶原COLI表达上升、MMPs表达上升及COLX表达上升等，使得体外培养的软骨细胞回植后常常形成纤维软骨，使得软骨的机械性能下降，导致进行透明软骨修复的效果达不到预期，成为影响治疗的长期效果的一个主要问题。

发明内容

本发明实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种能在体外维持与机体内软骨细胞特异性分化和表达水平相同的体外软骨细胞培养方法。

为了实现上述发明目的，本发明实施例的技术方案如下：

一种体外软骨细胞培养方法，包括如下步骤：

获取软骨细胞样本；

将所述软骨细胞样本进行原代培养；

将原代培养所得的软骨细胞进行传代培养，并在待传代培养至软骨细胞汇合度达到70～80％时，更换新鲜培养基并加入莱菔硫烷对软骨细胞进行处理。

采用本发明的体外软骨细胞培养方法，先通过原代培养在初期使其形态和特异分子表达水平等最大化地维持与机体内相同，使其能更好地显示与亲体组织紧密结合的形态学特征；之后再通过传代培养进行大量增殖，并且在适当的时机采用SFN进行退化抑制，有效缓解软骨细胞体外单层培养时的退化现象，为临床用软骨细胞的培养提供一种新的优良方法。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为本发明实施例原代培养细胞P0显微镜下的细胞形态图；

图2为本发明实施例第一次传代培养细胞P1显微镜下的细胞形态图；

图3为本发明实施例第二次传代培养细胞P2显微镜下的细胞形态图；

图4为本发明实施例原代培养细胞P0甲苯胺蓝染色后的形态结果图；

图5为本发明实施例第一次传代培养细胞P1甲苯胺蓝染色后的形态结果图；

图6为本发明实施例第二次传代培养细胞P2甲苯胺蓝染色后的形态结果图；

图7为本发明实施例传代培养的软骨细胞SFN处理后Col2a1蛋白基因的表达水平结果图；

图8为本发明实施例传代培养的软骨细胞SFN处理后Col1a1蛋白基因的表达水平结果图；

图9为本发明实施例传代培养的软骨细胞SFN处理后COL2A1/COL1A1表达结果图；

图10为本发明实施例中分别选用不同浓度SFN的培养基培养的软骨细胞MMP13的表达差异对比图；

图11为本发明实施例中采用8μM的SFN对传代培养的软骨细胞处理后COL2A1/COL1A1表达差异对比图；

图12为本发明实施例不同浓度SFN处理软骨细胞后I型胶原免疫荧光染色结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种体外软骨细胞培养方法，培养方法的细节实施过程，包括如下步骤：

S10，获取软骨细胞样本；

S20，将软骨细胞样本用培养基进行原代培养；

S30，将原代培养所得的软骨细胞进行传代培养；

S40，待传代培养中软骨细胞汇合度达到70～80％时，更换新鲜培养基并加入SFN；

S50，在SFN下传代培养至软骨细胞汇合度为80～90％时，收集细胞。