[发明专利]一步式真核细胞多基因修饰载体构建方法

权利要求书

1.一步式真核细胞多基因修饰载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)构建过表达质粒：

1.1)确定欲过表达的基因个数为N；

1.2)将欲过表达的N个基因的CDS区按顺序分别插入到N个质粒pOE-1、pOE-2直到pOE-N中，并转化大肠杆菌感受态细胞，过夜培养；

1.3)使用定点突变的方法将基因CDS中的BsaI位点进行突变，同时保证其所编码的氨基酸不变；

1.4)使用菌落PCR筛选出阳性克隆子并扩增；

1.5)分别提取N个质粒；

2)构建敲低质粒：

2.1)确定欲敲低的基因个数为N；

2.2)将欲敲低的N个基因的shRNA oligo按顺序分别引入到N个质粒pSH-1、pSH-2直到pSH-N中，并转化大肠杆菌感受态细胞，过夜培养；

2.3)挑选3个克隆子，并测序验证；

3)构建过表达和敲低混合质粒：

3.1)将欲过表达的基因的CDS或欲敲低的基因的shRNA oligo分别引入pOE质粒和pSH质粒中；

3.2)通过测序和菌落PCR验证序列的正确性，并将BsaI位点进行突变；

4)按体积比，在离心管中顺序加入如下样品：

5)将步骤4)混合体系混匀后置于PCR仪中，进行加热反应；

6)反应结束后，取出反应物，并加入ATP和PlasmidSafe DNase，其中，反应产物、ATP与PlasmidSafe DNase体积比为16:2:2；

7)步骤6)所得体系在37℃条件下孵育，然后将反应产物转化入感受态细胞中，并涂布于含有IPTG和X-gal的kana平板上，37℃孵育过夜；

8)第二天，挑取3个蓝色菌落进行扩增；

9)第三天，提取质粒并鉴定；

所述的N为大于1的正整数，

pOE质粒均包含有一个CMV启动子、一个多克隆位点、一个bGH polyA序列、一个ori复制区和一个四环素抗性基因，并且两个BsaI位点分别位于CMV启动子上游和bGH polyA序列下游；pOE-1～pOE-10质粒区别仅仅是BsaI切割位点序列不同，其余结构部分完全相同，其中质粒pOE-1～pOE-10用于基因的过表达；

pSH质粒均包含有一个U6启动子、一个多克隆位点、一个ori复制区和一个四环素抗性基因，两个BsaI位点分别位于U6启动子上游和下游；pSH-1～pSH-10质粒区别仅仅是BsaI切割位点序列不同，其余结构部分完全相同，pSH-1～pSH-10用于基因的敲低；

pBL质粒均包含有一段100bp的非编码stuffer序列、一个多克隆位点、一个ori复制区和一个四环素抗性基因，两个BsaI位点分别位于非编码stuffer序列的上游和下游；pBL-1～pBL-10质粒区别仅仅是BsaI切割位点序列不同，其余结构部分完全相同，pBL-1～pBL-10用于填补位置空缺；

pDV质粒均包含有一个CMV启动子、一个EGFP编码序列、一个SV40polyA序列、一个SV40启动子、一个NeoR/KanaR序列、一个ori复制区和一个lacZ基因，两个BsaI位点分别位于lacZ基因的上游和下游；pDV-1～pDV-10质粒区别仅仅是BsaI切割位点序列不同，其余结构部分完全相同，pDV-1～pDV-10为最终目的载体。

2.根据权利要求1所述的一步式真核细胞多基因修饰载体构建方法，其特征在于，所述的过表达质粒、敲低质粒或过表达和敲低混合质粒提取后，将质粒浓度调整到200ng/μl。

3.根据权利要求1所述的一步式真核细胞多基因修饰载体构建方法，其特征在于，所述的pDV-N质粒浓度为25ng/μl，所述的ATP浓度为10mM。

4.根据权利要求1所述的一步式真核细胞多基因修饰载体构建方法，其特征在于，步骤5)中，进行加热反应的程序为：

37℃加热5min，然后20℃加热5min，进行20个循环后，再继续37℃加热5min，之后升温到80℃加热20min。