[发明专利]一步式真核细胞多基因修饰载体构建方法

说明书

本发明涉及一步式真核细胞多基因修饰载体构建方法，首先应确定欲修饰的基因数目N，然后将各个基因的CDS区分别引入pOE‑1至pOE‑N中，同时也可以将每个基因对应的shRNA序列分别引入pSH‑1至pSH‑N中。通过将pOE‑1至pOE‑N和pDV‑N加入同一个反应体系中，即可一步式构建出N个基因串联过表达的最终质粒；或者将pSH‑1至pSH‑N和pDV‑N加入同一个反应体系中，即可一步式构建出N个基因同时knock‑down的最终质粒；同样的，也可以选择其中几个基因的过表达质粒和另外基因的knock‑down质粒和pDV‑N加入同一个反应体系中，即可一步式构建出既含有多个基因过表达，同时将另一些基因knock‑down的最终载体。与现有技术相比，本发明的构建过程一步式，过程简便，效率高，同时可对多个目的基因进行任意组合。

技术领域

本发明涉及一种一步式真核细胞多基因修饰载体构建方法，属于真核细胞水平基因功能分析技术领域。

背景技术

真核细胞多基因修饰载体构建一般需要多步骤进行，方法繁琐。

目前商业化的相似产品主要包括Clontech公司的In-fusion试剂盒与NEB公司的Gibson组装试剂盒，两种产品仅提供连接反应体系，用户需要自己准备载体体系而且两个公司的反应体系存在下列限制：

1)需要进行长片段的PCR扩增，从而使得最终构建的多基因表达载体容易产生突变；

2)两种方法均需要额外合成多条引物，并且增加了PCR扩增、产物胶回收等步骤，既增加了额外费用，又较繁琐；

3)两种方法构建的载体需要特异的感受态细胞进行转化，不适用实验室普通感受态细胞，需要额外进行购置。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种广泛应用于真核细胞水平基因功能分析实验的一步式真核细胞多基因修饰载体构建方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一步式真核细胞多基因修饰载体构建方法，包括以下步骤：

1)构建过表达质粒：

1.1)确定欲过表达的基因个数为N，所述的N为大于1的正整数，下同；；

1.2)将欲过表达的N个基因的CDS区按顺序分别插入到N个质粒pOE-1、pOE-2直到pOE-N中，并转化大肠杆菌感受态细胞，过夜培养；

1.3)使用定点突变的方法将基因CDS中的BsaI位点进行突变，同时保证其所编码的氨基酸不变；

1.4)使用菌落PCR筛选出阳性克隆子并扩增；

1.5)分别提取N个质粒，并将质粒浓度调整到200ng/μl；

2)构建敲低质粒：

2.1)确定欲敲低的基因个数为N；

2.2)将欲敲低的N个基因的shRNA oligo按顺序分别引入到N个质粒pSH-1、pSH-2直到pSH-N中，并转化大肠杆菌感受态细胞，过夜培养；

2.3)挑选3个克隆子，并测序验证，并将质粒浓度调整到200ng/μl；

3)构建过表达和敲低混合质粒：

3.1)将欲过表达的基因的CDS或欲敲低的基因的shRNA oligo分别引入pOE质粒和pSH质粒中，例如，欲过表达第1、3和5号基因，而欲敲低第2、4和6号基因，则将第1、3和5号基因的CDS区域分别引入pOE-1、pOE-3和pOE-5中，而将第2、4和6号基因的shRNA oligo引入到pSH-2，pSH-4和pSH-6中；