[发明专利]双色荧光定位超分辨率生物显微方法及系统

权利要求书

1.一种双色荧光定位超分辨率生物显微方法，其特征在于，包括有：

使用Alexa647和Alexa750荧光分子，或Cy5和Cy7荧光分子对生物样品进行双色荧光标记，并将所述生物样品浸泡在成像缓冲液中；

通过激光照射所述生物样品，分别产生与所述Alexa647或Cy5荧光分子对应的第一通道闪烁荧光信号，以及与所述Alexa750或Cy7荧光分子对应的第二通道闪烁荧光信号；

根据所述第一通道闪烁荧光信号和所述第二通道闪烁荧光信号，分别构建第一生物结构超分辨率图像和第二生物结构超分辨率图像；

将所述第一生物结构超分辨率图像和所述第二生物结构超分辨率图像进行对准处理以构建出第三生物结构超分辨率图像。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述通过激光照射所述生物样品的步骤包括：

通过预定的激活激光照射所述生物样品以开启荧光信号，并通过预定的激发激光照射所述生物样品以关闭荧光信号，以产生闪烁荧光信号。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述激活激光具有紫色或紫外波长；所述激发激光具有Alexa647和Alexa750荧光分子激发波长，或者所述激发激光具有Cy5和Cy7荧光分子激发波长；使用预定的激发激光功率和激活激光功率，使同一时刻大部分的荧光分子关闭荧光信号，仅有小部分离散的荧光分子开启荧光信号。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述成像缓冲液包含有TCEP、环辛四烯、除氧剂、甲基紫精和/或抗坏血酸；或者

所述成像缓冲液包含有巯基物、环辛四烯、除氧剂、甲基紫精和/或抗坏血酸。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述TCEP或巯基物与荧光分子在所述激发激光的照射下结合形成加合物，所述加合物不会在所述激发激光的照射下发出荧光；所述加合物在所述激活激光的照射下重新分解为所述TCEP或巯基物和荧光分子，所述荧光分子发出荧光。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述环辛四烯包括环辛四烯的衍生物；所述除氧剂包括葡萄糖氧化酶、葡萄糖和过氧化氢酶的组合，或者，所述除氧剂包括吡喃糖氧化酶、葡萄糖和过氧化氢酶的组合。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述根据第一通道闪烁荧光信号和所述第二通道闪烁荧光信号，分别构建第一生物结构超分辨率图像和第二生物结构超分辨率图像的步骤之前还包括：

在数据采集之前，通过实时锁定系统将所述生物样品的位置实时锁定。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述实时锁定系统将所述生物样品的位置实时锁定的步骤包括：

为所述生物样品提供明场照明，所述生物样品的明场图像经过前成像透镜成像于锁定相机；

从所述锁定相机中抓取一张生物样品或参照体的明场图像作为锁定模板；

从所述锁定相机中实时抓取所述生物样品的当前明场图像，将所述当前明场图像与所述锁定模板进行对比；

计算所述当前明场图像与所述锁定模板之间的偏移量；

根据所述偏移量对所述当前明场图像进行偏移补偿处理。

9.根据权利要求1～8任一项所述的方法，其特征在于，所述根据第一通道闪烁荧光信号和所述第二通道闪烁荧光信号，分别构建第一生物结构超分辨率图像和第二生物结构超分辨率图像的步骤还包括：

通过双色荧光定位超分辨率显微镜获取所述第一通道闪烁荧光信号和所述第二通道闪烁荧光信号；

通过所述双色荧光定位超分辨率显微镜的分光系统将所述第一通道闪烁荧光信号和所述第二通道闪烁荧光信号分离，并分别成像于相机的感光元件的不同区域；

获取所述相机采集的每一张图像，通过高斯拟合确定所述图像中每个荧光分子的爱里斑中心坐标并记录；

根据记录的所述爱里斑中心坐标分别构建所述第一通道闪烁荧光信号对应的所述第一生物结构超分辨率图像和所述第二通道闪烁荧光信号对应的所述第二生物结构超分辨率图像。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述双色荧光定位超分辨率显微镜为倒置的全反射荧光显微镜；

所述相机为EMCCD相机；和/或

所述分光系统包括矩形光阑、双色反射镜和两个滤镜。