[发明专利]双色荧光定位超分辨率生物显微方法及系统

说明书

技术领域

本发明涉及通信技术领域，尤其涉及一种双色荧光定位超分辨率生物显微方法及系统。

背景技术

自恩斯特·阿贝(Ernst Abbe)于十八世纪七十年代提出光学成像分辨率极限的理论以来，人们一直在寻找各种各样的方法方式以求突破这一分辨率极限。目前，通过运用现代尖端技术，庄小威，埃里克·贝齐格(Eric Betzig)分别于2006年先后分别提出了随机光学重构显微技术(Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，SORM)和荧光定位显微技术(Photoactivation Laser Microscopy，PLM)，均实现了突破光学分辨率极限十倍的超分辨率成像。埃里克·贝齐格更是通过这一技术获得了2014年诺贝尔化学奖。目前荧光定位显微技术已经实现部分商业化，并且开始被用于基础生命科学，尤其是分子生物学以及生物化学的研究当中。通过这一技术，研究人员可以以10到20纳米的横向分辨率和50纳米的纵向分辨率研究生物样品的细节结构。与其他已有的超分辨率技术，如电子显微技术相比，荧光定位显微技术大大简化了样品的制备环节，并且可以实现活体细胞成像。更重要的是，荧光定位显微技术可以轻松的实现多通道共定位成像，从而得到蛋白质之间的相互作用关系，为大量分子生物研究课题提供最直接的证据。然而，现有技术在多色超分辨率成像方面的表现仍有不足之处。尼康(Nikon)N-STORM作为商业化荧光定位显微镜的代表，其多通道成像使用由两种不同激发波长荧光分子结合而成的“荧光开关”(例如，Alexa647-Alexa488分子对以及Alexa467-Alexa405分子对)作为标记物。这种方法可以实现不同成像通道的快速切换，但是这类荧光开关的标记物目前并无商业化，且实验室制备较为复杂。更重要的是，这种多色成像的方法会产生较严重的通道串扰(Channel Crosstalk)，产生错误的共定位信息。徕卡(Leica)SR GSD定位显微镜使用不同激发波长的普通荧光分子作为标记物(例如，Alexa647和Alexa532)，并使用滤镜系统来实现多通道成像。这一方法的局限性在于，短激发波长荧光分子极易被光漂白(Photo-bleach)，并且较短的激发波长会导致细胞的自发荧光背景，影响成像质量。

另外，样品漂移是一种普遍存在于超分辨率荧光定位显微镜的问题。这是指由于环境的不稳定，如气流、温度变化、噪音等等，会使样品在拍摄过程中发生几十至几百纳米的移动。尽管这一漂移现象普遍存在于显微系统中，由于一般显微镜的分辨率不足300纳米，漂移造成的现象并不明显。但是对于分辨率可达十几纳米的超分辨率显微镜而言，漂移会对成像造成严重的干扰。目前已有的解决方法大多为向样品中加入荧光颗粒，并在成像中记录这些颗粒的位移，随后从所得超分辨率图像中将这一位移减去。其缺陷是制备麻烦；而且荧光颗粒会占用一个成像通道；另外，由于光漂白，荧光颗粒的荧光会随成像时间衰减，因此漂移的修正精度也会随时间变差。

综上可知，现有技术在实际使用上显然存在不便与缺陷，所以有必要加以改进。

发明内容

针对上述的缺陷，本发明的目的在于提供一种双色荧光定位超分辨率生物显微方法及系统，其不会产生通道串扰，并且可大幅降低背景噪音，从而提高了成像质量。

为了实现上述目的，本发明提供一种双色荧光定位超分辨率生物显微方法，包括有：

使用Alexa647和Alexa750荧光分子，或Cy5和Cy7荧光分子对生物样品进行双色荧光标记，并将所述生物样品浸泡在成像缓冲液中；

通过激光照射所述生物样品，分别产生与所述Alexa647或Cy5荧光分子对应的第一通道闪烁荧光信号，以及与所述Alexa750或Cy7荧光分子对应的第二通道闪烁荧光信号；

根据所述第一通道闪烁荧光信号和所述第二通道闪烁荧光信号，分别构建第一生物结构超分辨率图像和第二生物结构超分辨率图像；

将所述第一生物结构超分辨率图像和所述第二生物结构超分辨率图像进行对准处理以构建出第三生物结构超分辨率图像。

根据本发明所述的方法，所述通过激光照射所述生物样品的步骤包括：

通过预定的激活激光照射所述生物样品以开启荧光信号，并通过预定的激发激光照射所述生物样品以关闭荧光信号，以产生闪烁荧光信号。