[发明专利]基于滚环扩增技术的检测左旋色氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物化学、分子生物学、氨基酸成分确认的检测方法，具体涉及一种基于滚环扩增技术的检测左旋色氨酸的方法。

背景技术

左旋色氨酸(L-Trp)是构成蛋白质的20种天然氨基酸之一，是人体的8种必需氨基酸之一。作为重要的营养物质，许多的食物(原料、半成品、产品等)、饮料和调味品中都含有色氨酸。如何方便、快捷和准确的对色氨酸进行定量分析在食品检测中具有重要意义。

色氨酸在生物体内除了合成蛋白质外，其很多代谢产物具有重要的生物学功能及意义。人体内的色氨酸主要通过两种途径代谢：血清素途径和犬尿氨酸途径。在血清素代谢途径即5-羟色胺途径中，首先色氨酸羟化酶催化色氨酸生成5-羟色氨酸，然后在脱羧酶作用下5-羟色氨酸生成5-羟色胺。在犬尿氨酸途径中，吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)和色氨酸2,3双加氧酶(TDO)催化色氨酸生成N-甲酰犬尿氨酸。代谢过程中产生的5羟色胺是一种重要的神经递质，参与神经系统的众多生理功能的调节。犬尿喹啉酸是一种兴奋性氨基酸受体的拮抗剂。色氨酸代谢途径的异常可以引起体液中色氨酸浓度的变化。因此，对色氨酸浓度进行定量检测具有重要的医学诊断和治疗价值。

目前，最常用的检测色氨酸的方法有HPLC法、质谱法、层析法、紫外吸收法、荧光光谱法等。但是，这些检测分析方法均需要大型专业分析仪器设备，不仅需要专业人员来进行操作，而且对设备维护和标准化的要求也比较高。不能制备方便的小型化试剂盒。目前，可用于试剂盒检测色氨酸的仅有ELISA法，该方法利用色氨酸抗体与色氨酸的结合检测色氨酸，虽然降低了大型专业仪器设备的要求，但是该检测方法需要包被、铺板、加样、加抗体、显色以及每一步之间的多次洗涤步骤，操作繁琐，易于出现人为误差。因此，开发新的检测方法，实现简便、快捷、特异性高、性价比高的色氨酸检测具有重要的意义。

发明内容

本发明针对上述现有技术存在的问题而提出一种基于滚环扩增技术的全新的检测左旋色氨酸的方法，该方法原理是利用色氨酸操纵子的阻遏蛋白以及滚环扩增，通过该方法可以实现左旋色氨酸的简便、快捷、可定量的检测。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种基于滚环扩增技术的检测左旋色氨酸的方法，其特征在于包括下述步骤：待检测的左旋色氨酸与色氨酸阻遏蛋白结合，结合了左旋色氨酸的色氨酸阻遏蛋白通过识别由环形单链模板DNA与线性单链引物DNA形成的双链上的特异性识别序列，进而抑制DNA聚合酶对线性单链引物DNA的延伸和扩增，滚环扩增反应的抑制程度与左旋色氨酸的浓度成正比，通过制备左旋色氨酸浓度与滚环扩增抑制率的标准曲线，检测待测样品对滚环扩增的抑制率，确定出待测样品中的左旋色氨酸含量。

所述的待检测的左旋色氨酸可以是配制的L-Trp溶液，或是各种提取或制备的生物样本。

所述的色氨酸阻遏蛋白是细菌中调控色氨酸操纵子表达的阻遏蛋白(trpR)，该蛋白能够特异性地结合L-Trp，并发生构象变化，提高了结合色氨酸操纵子识别序列的亲和力。

所述的环形单链模板DNA，是作为扩增模板用于滚环扩增的单链DNA，并含有trpR的识别序列。

所述的线性单链引物DNA，是作为扩增引物用于滚环扩增的线性单链DNA，并含有trpR的识别序列，该线性单链引物DNA序列与环形单链模板DNA的序列碱基具有序列互补性。

所述的DNA聚合酶是用于滚环扩增的DNA聚合酶，包括但不限于phi29DNA聚合酶。

与传统的HPLC、质谱、ELISA方法相比，本发明具有如下优点：

1、操作简单、步骤简便；

2、不需专业的大型仪器设备。

附图说明

图1是本发明的流程图。

图2是本发明检测L-Trp的原理示意图。

图中，1、含有trpR识别序列的单链模板DNA：“ON-CT”；2、含有trpR识别序列的单链引物DNA：“ON-P”；3、DNA聚合酶；4、未结合L-Trp的trpR蛋白；5、结合L-Trp的trpR蛋白；6、L-Trp。

图3是本发明定量测定不同浓度L-Trp的实验结果。(A)L-Trp不同浓度时的RCA反应的荧光时间曲线；(B)L-Trp浓度和IRR的线性关系。Fluorescence intensity(FI)：荧光强度；Time：时间；Inhibited RCA rate(IRR)：RCA速率抑制率；L-Trp Concentration(μM)：左旋色氨酸浓度(微摩尔每升)。