[发明专利]一种装甲CTLA-4基因的RNA标准物质及其应用

权利要求书

1.一种装甲CTLA-4基因的RNA标准物质，其特征在于：所述装甲CTLA-4基因的RNA标准物质由如下步骤制得：

步骤10、获得用于CTLA-4核酸检测的C基因序列片段，如序列表中SEQ ID NO.1 所示，所述C基因为CTLA-4基因中的一个片段；

步骤20、获取包含MS2噬菌体成熟酶蛋白基因和衣壳蛋白基因的表达载体，具体过程如下：

根据MS2噬菌体基因序列，设计一对特异性引物，所述一对特异性引物如下：MCP1:5'- CGGGGTACCCTAGGAGGTTTGACCTGTGCGAGC-3' ； MCP2: 5'-CGGGATCCGTTAGTAGATGCCGGAGTTT-3' ；预期扩增产物为MS2噬菌体的外壳蛋白和成熟酶蛋白基因，即CP基因，并引入双酶切位点：KpnⅠ和BamHⅠ；分别双酶切CP基因及PET32a载体，并将CP基因连接到PET32a载体上，最终得到PET32a-CP载体；所述CP基因序列如序列表中SEQ ID NO.４所示；

步骤30、CTLA-4 C基因和CP基因的表达载体的获取，具体如下：

携带C基因的T载体，在Not Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后，进行凝胶电泳后回收140bp小片段；同时进行PET32a-CP载体Not Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切，进行凝胶回收7115bp大片段，利用T4连接酶进行小片段和大片段连接，将CDS基因插入PET32a载体T7启动子下游，获得原核表达载体PET32a-CP-CTLA-4；

步骤40、原核表达载体PET32a-CP-CTLA-4转入原核表达菌株BL21（DE3）PLySs中，诱导表达，采用冷冻低温冻融，离心，纯化后，获得表达产物颗粒；

步骤50、将步骤40获得的表达产物颗粒进行DNase Ⅰ 消化，然后离心弃沉淀，保留上清；加入终浓度4M硫酸铵，沉淀表达产物，离心弃上清，获得沉淀即是含有CTLA-4基因的表达产物，最后用1×TE溶液重悬，获得含有CTLA-4 C基因RNA假病毒颗粒产物；

步骤60、将含有CTLA-4 C基因RNA假病毒颗粒产物用TE缓冲液稀释，进行VP病毒颗粒OD值测定，依据OD值换算稀释产物，获得内含CTLA-4基因RNA标准物质，即装甲CTLA-4基因的RNA标准物质。

2.根据权利要求1所述的一种装甲CTLA-4基因的RNA标准物质，其特征在于：所述步骤10中，C基因可以通过体外化学合成或RT-PCR扩增获得，并连接入T载体，其中T载体含有Not Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点；所述C基因片段处于CTLA-4的CDS区域，所述RT-PCR扩增引物如下：

PrimerＬ：AGGGAAGTTTTGTGGAGGAGC；

PrimerＲ：GCACAATTCCACGCAATCA。

3.根据权利要求2所述的一种装甲CTLA-4基因的RNA标准物质，其特征在于：所述步骤40具体如下：

将原核表达载体PET32a-CP-CTLA-4载体转入原核表达菌BL21（DE3）PLySs，从中挑选出阳性克隆菌BL21（DE3）PLySs接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中，进行诱导表达；最后离心，收集菌体沉淀，用TE缓冲液或PBS洗涤；再次收集沉淀完成后放入-20℃至-80℃度冰箱中隔4-6小时取出至温室，反复3-4次，离心，向沉淀中加入1~20mg/ml溶菌酶缓冲液，25~37℃孵育20-60min，离心弃去沉淀，获得表达产物颗粒。

4.根据权利要求3所述的一种装甲CTLA-4基因的RNA标准物质，其特征在于：所述缓冲液为20mM Tris 、0.2M NaCl 、pH8.0。

5.权利要求1~4任一项所述的一种装甲CTLA-4基因的RNA标准物质在免疫抑制因子CTLA-4核酸检测中作为标准物质的应用。