[发明专利]一种装甲CTLA-4基因的RNA标准物质及其应用在审
申请号: | 201410794484.1 | 申请日: | 2014-12-19 |
公开(公告)号: | CN104531740A | 公开(公告)日: | 2015-04-22 |
发明(设计)人: | 连文昌;阮润生;黄丽萍;李剑 | 申请(专利权)人: | 安特诺生物医药(厦门)有限公司 |
主分类号: | C12N15/66 | 分类号: | C12N15/66;C12N15/70;C12Q1/68 |
代理公司: | 厦门市新华专利商标代理有限公司 35203 | 代理人: | 朱凌 |
地址: | 361000 福建省厦门*** | 国省代码: | 福建;35 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 装甲 ctla 基因 rna 标准 物质 及其 应用 | ||
1.一种装甲CTLA-4基因的RNA标准物质,其特征在于:所述装甲CTLA-4基因的RNA标准物质由如下步骤制得:
步骤10、获得用于CTLA-4核酸检测的C基因序列片段,如序列表中SEQ ID NO.1 所示,所述C基因为CTLA-4基因中的一个片段;
步骤20、获取包含MS2噬菌体成熟酶蛋白基因和衣壳蛋白基因的表达载体,具体过程如下:
根据MS2噬菌体基因序列,设计一对特异性引物,所述一对特异性引物如下:MCP1:5'- CGGGGTACCCTAGGAGGTTTGACCTGTGCGAGC-3' ; MCP2: 5'-CGGGATCCGTTAGTAGATGCCGGAGTTT-3' ;预期扩增产物为MS2噬菌体的外壳蛋白和成熟酶蛋白基因,即CP基因,并引入双酶切位点:KpnⅠ和BamHⅠ;分别双酶切CP基因及PET32a载体,并将CP基因连接到PET32a载体上,最终得到PET32a-CP载体;所述CP基因序列如序列表中SEQ ID NO.4所示;
步骤30、CTLA-4 C基因和CP基因的表达载体的获取,具体如下:
携带C基因的T载体,在Not Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后,进行凝胶电泳后回收140bp小片段;同时进行PET32a-CP载体Not Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,进行凝胶回收7115bp大片段,利用T4连接酶进行小片段和大片段连接,将CDS基因插入PET32a载体T7启动子下游,获得原核表达载体PET32a-CP-CTLA-4;
步骤40、原核表达载体PET32a-CP-CTLA-4转入原核表达菌株BL21(DE3)PLySs中,诱导表达,采用冷冻低温冻融,离心,纯化后,获得表达产物颗粒;
步骤50、将步骤40获得的表达产物颗粒进行DNase Ⅰ 消化,然后离心弃沉淀,保留上清;加入终浓度4M硫酸铵,沉淀表达产物,离心弃上清,获得沉淀即是含有CTLA-4基因的表达产物,最后用1×TE溶液重悬,获得含有CTLA-4 C基因RNA假病毒颗粒产物;
步骤60、将含有CTLA-4 C基因RNA假病毒颗粒产物用TE缓冲液稀释,进行VP病毒颗粒OD值测定,依据OD值换算稀释产物,获得内含CTLA-4基因RNA标准物质,即装甲CTLA-4基因的RNA标准物质。
2.根据权利要求1所述的一种装甲CTLA-4基因的RNA标准物质,其特征在于:所述步骤10中,C基因可以通过体外化学合成或RT-PCR扩增获得,并连接入T载体,其中T载体含有Not Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点;所述C基因片段处于CTLA-4的CDS区域,所述RT-PCR扩增引物如下:
PrimerL:AGGGAAGTTTTGTGGAGGAGC;
PrimerR:GCACAATTCCACGCAATCA。
3.根据权利要求2所述的一种装甲CTLA-4基因的RNA标准物质,其特征在于:所述步骤40具体如下:
将原核表达载体PET32a-CP-CTLA-4载体转入原核表达菌BL21(DE3)PLySs,从中挑选出阳性克隆菌BL21(DE3)PLySs接种于含有氨苄青霉素的LB培养基中,进行诱导表达;最后离心,收集菌体沉淀,用TE缓冲液或PBS洗涤;再次收集沉淀完成后放入-20℃至-80℃度冰箱中隔4-6小时取出至温室,反复3-4次,离心,向沉淀中加入1~20mg/ml溶菌酶缓冲液,25~37℃孵育20-60min,离心弃去沉淀,获得表达产物颗粒。
4.根据权利要求3所述的一种装甲CTLA-4基因的RNA标准物质,其特征在于:所述缓冲液为20mM Tris 、0.2M NaCl 、pH8.0。
5.权利要求1~4任一项所述的一种装甲CTLA-4基因的RNA标准物质在免疫抑制因子CTLA-4核酸检测中作为标准物质的应用。
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