[发明专利]一种装甲CTLA-4基因的RNA标准物质及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种装甲CTLA-4基因的RNA标准物质及其应用。

背景技术

 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）是表达于激活T细胞表面，作为淋巴细胞激活的共刺激信号。在T细胞活化中起到负调节作用。它与淋巴细胞激活因子CD28起相反作用。但CTLA-4与CDA28分子在基因结构、染色体定位、序列的同源性及基因表达等方面都十分相近。氨基酸上两者有31%同源性。具有同样的相同的受体B7分子。但CTLA4与B7结合亲和力比CD28与B7亲和力高10~20倍，这就说明只要在少量CTLA-4情况下，即可阻断CD28与B7的结合，从而抑制T细胞活化。当阻断CTLA-4时，可以增加T细胞的激活或增殖。2010年抗CTLA-4单克隆抗体被FDA批准应用于不可切除或转移性黑色素瘤。抗CTLA-4抗体针对免疫抑制检验点制备出针对肿瘤免疫只治疗比较有效的抗肿瘤药物。因此，对于CTLA-4的研究是抗肿瘤有效方法。那么首先就是对CTLA-4 因子核酸水平检测。可以利用核酸检测方法可以准确、快速、灵敏的判定CTLA-4核酸水平。从而对抗CTLA-4单克隆抗体药物的应用提供核酸水平的参考依据，最终提高药物疗效，使之高效的治愈肿瘤。  

CTLA-4又称CD152，位于染色体2号长臂33，CTLA-4基因编码的蛋白质有223个氨基酸，672个开放性阅读框和4个外显子。4个外显子分别编码一个引导序列、一个v区域、一个跨膜区域和一个胞质尾区。利用CTLA-4外显子上特异性CDS区可以检测CTLA-4核酸的存在。作为核酸检测CTLA-4的特异性靶点。目前国内还没有诊断CTLA-4核酸检测试剂及质控产品。因此，研制一种检测CTLA-4核酸表达水平的质控样品和标准物质，对于临床检测CTLA-4免疫因子表达情况具有重要的意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题，在于提供一种装甲CTLA-4基因的RNA标准物及其应用，该物质具有稳定性，无生物传染性，可真实模拟病毒粒子结构，耐核糖核酸酶等特性，可用于淋巴细胞CTLA-4基因mRNA水平检测方法和试剂盒的阳性质控物质。

本发明是这样实现的：

一种装甲CTLA-4基因的RNA标准物质，所述装甲CTLA-4基因的RNA标准物质由如下步骤制得：

步骤10、获得用于CTLA-4核酸检测的C基因序列片段，如序列表中SEQ ID NO.1 所示，所述C基因为CTLA-4基因中的一个片段；

步骤20、获取包含MS2噬菌体成熟酶蛋白基因和衣壳蛋白基因的表达载体，具体过程如下：

根据MS2噬菌体基因序列，设计一对特异性引物，所述一对特异性引物如下：MCP1:5'- CGGGGTACCCTAGGAGGTTTGACCTGTGCGAGC-3'； MCP2: 5'-CGGGATCCGTTAGTAGATGCCGGAGTTT-3' ；预期扩增产物为MS2噬菌体的外壳蛋白和成熟酶蛋白基因，即CP基因，并引入双酶切位点：KpnⅠ和BamHⅠ；分别双酶切CP基因及PET32a载体，并将CP基因连接到PET32a载体上，最终得到PET32a-CP载体；所述CP基因序列如序列表中SEQ ID NO.４所示；

步骤30、CTLA-4 C基因和CP基因的表达载体的获取，具体如下：

携带C基因的T载体，在Not Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后，进行凝胶电泳后回收140bp小片段；同时进行PET32a-CP载体Not Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切，进行凝胶回收7115bp大片段，利用T4连接酶进行小片段和大片段连接，将C基因插入PET32a载体T7启动子下游，获得原核表达载体PET32a-CP-CTLA-4；

步骤40、原核表达载体PET32a-CP-CTLA-4转入原核表达菌株BL21（DE3）PLySs中，诱导表达，采用冷冻低温冻融，离心，纯化后，获得表达产物颗粒；

步骤50、将步骤40获得的表达产物颗粒进行DNase Ⅰ 消化，然后离心弃沉淀，保留上清；加入终浓度4M硫酸铵，沉淀表达产物，离心弃上清，获得沉淀即是含有CTLA-4基因的表达产物，最后用1×TE溶液重悬，获得含有CTLA-4 C基因RNA假病毒颗粒产物；

步骤60、将含有CTLA-4 C基因RNA假病毒颗粒产物用TE缓冲液稀释，进行VP病毒颗粒OD值测定，依据OD值换算稀释产物，获得内含CTLA-4基因RNA标准物质，即装甲CTLA-4基因的RNA标准物质。