[发明专利]一种三代虫纯种人工感染系统的建立方法

说明书

技术领域

本发明属于水产病害防治领域，涉及一种三代虫纯种人工感染系统的建立方法，具体涉及一种寄生于金鱼上的小林三代虫纯种人工感染系统的建立方法。

背景技术

素有寄生虫界“果蝇”之称的三代虫(Gyrodactylus)隶属于扁形动物门、单殖吸虫纲、三代虫目、三代虫科，是一类常见的鱼类体外寄生虫，一般寄生于海水和淡水鱼类的鳃、体表及鳍条。自三代虫被发现以来，三代虫便因其独特的繁殖方式及很强的宿主特异性而受到人们的普遍关注，早期更作为发育生物学的胚胎发育研究的经典模型。自20世纪70年代以来，国外有关三代虫的研究蓬勃发展，涉及到三代虫的形态分类、生长发育、种系发生、种群动态、宿主免疫等各个方面。然而，国内在这方面的研究却较少，主要原因之一就是三代虫在鱼体上种类繁多，不易鉴定；另外，更重要的是缺少一种三代虫的室内实验模型，即纯种人工感染系统，这个人工感染系统的建立，不仅为三代虫的基础理论研究提供实验平台，也将会为三代虫病防治药物的研究提供十分有用的动物模型。

近年来，随着鱼类养殖密度不断提高和养殖环境的恶化，单殖吸虫(主要为指环虫和三代虫)引起的疾病越来越严重，给渔业生产造成了巨大的经济损失。目前，单殖吸虫病常用的防治药物有福尔马林、鱼藤酮、甲苯咪唑、敌百虫等化学药物，然而，由于这些药物长期、频繁的使用，导致单殖吸虫抗药性的产生，严重影响药效，使得三代虫病和指环虫病防治的难度加大。为了保障水产养殖业的健康发展，筛选、研制新的鱼药显得非常必要。然而，由于缺少一种单殖吸虫纯种人工感染系统，评价鱼药的药效是很难完成的。

总的来说，建立一种纯种三代虫的人工感染系统无论是对三代虫的生物学的研究还是对单殖吸虫病害的防控都具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是以金鱼为宿主建立一种可为药物筛选、新鱼药研制提供动物模型的三代虫纯种人工感染系统的建立方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术手段：

一种三代虫纯种人工感染系统的建立方法，其特征在于：所述三代虫纯种人工感染系统的建立方法包括以下步骤：

1)健康无虫金鱼的获取：

1.1)将购买的金鱼暂养在盛有曝气自来水的水族箱中5-8天；

1.2)将经过步骤1.1)后的金鱼用100mg/L的福尔马林溶液浸泡12h，连续浸泡3次，每次间隔为2天；

1.3)浸泡结束后，将金鱼在曝气自来水中继续养殖，所述养殖时间不低于1周；

1.4)随机选取多尾金鱼，用50mg/L的MS-222溶液麻醉后，在体视显微镜下观察鱼类的鳃、体表以及鳍条，确认无三代虫，得到健康无虫金鱼；

2)三代虫的人工感染：

2.1)从已经感染三代虫的金鱼尾鳍上选取1条三代虫；

2.2)将步骤2.1)所选取的三代虫置于经步骤1.4)麻醉后的健康无虫金鱼的尾鳍上；

2.3)待三代虫附着鳍条之后，将该金鱼养殖在一个隔离的且盛有曝气自来水的玻璃缸中；

2.4)养殖时间不低于12h后，将步骤2.3)中金鱼再次用50mg/L的MS-222溶液麻醉，置于体视显微镜下观察金鱼的鳍条是否有三代虫，若有，则进行步骤2.5)；若无，则返回执行步骤2.1)至步骤2.4)直至三代虫感染成功后进行步骤2.5)；

2.5)将感染成功后的金鱼与步骤1.4)中数量相同的健康金鱼混养，一周后，从混养的金鱼中随机选取一尾，小心取下其鳍条上的三代虫进行形态学鉴定以及分子鉴定，若经形态学鉴定以及分子鉴定后确认均是同一种三代虫，则将感染三代虫的金鱼与健康无虫金鱼按照1:4的比例混养，以得到更多的感染同一种三代虫的金鱼；若经形态学鉴定以及分子鉴定后确认不是同一种三代虫，则舍弃已感染三代虫的所有金鱼。

作为优选，本发明提供的三代虫纯种人工感染系统的建立方法在步骤2)之后还包括：

3)三代虫人工感染后的维持：

将感染三代虫的金鱼养于盛有曝气自来水的水族箱中，控制水温在20±1℃；保持水族箱中的水质清新，每天投喂1％鱼体重的商业颗粒饲料，定期投放定量的健康无虫金鱼。

作为优选，本发明所提供的三代虫纯种人工感染系统的建立方法在步骤2.5)中形态学鉴定的具体实现方式是：