[发明专利]基于小球藻的金属硫蛋白制备方法

权利要求书

1.基于小球藻的金属硫蛋白制备方法，其特征在于：按照下述步骤进行：

步骤1，将培养液置于反应器内，120℃下灭菌，放入小球藻藻种，再置于25℃光照培养箱中，培养12h，然后将反应器置于25℃无光照的培养箱中，培养5h，然后再放入有光照的培养箱中培养12h，如此重复3-10次，向处于对数生长期的小球藻中加入5-100μmol/L锌离子溶液，培养24-120h后，再向经过上述处理后的小球藻中加入5-100μmol/L铜离子溶液，再培养3-10天；

步骤2，培养3-10天后，将培养液以及其中的小球藻进行微孔滤膜浓缩，浓缩至原培养液体积的0.2-0.6％，膜浓缩参数：膜浓缩压力为0.05-0.09MPa，膜浓缩温度为25-30℃，得小球藻浓缩液；

步骤3，将步骤2中所得的小球藻浓缩液在常温下进行压力破壁，所述常温压力破壁的条件：破壁温度为25℃，破壁压力为300-500MPa，破壁时间为1-2h，得到破壁后的混合藻液；

步骤4，将步骤3中得到的破壁后的混合藻液用80-95％的乙醇溶液进行叶绿素的提取，提取温度为55-65℃，提取时间为5-7h，提取3-5次，提取后的混合液经过离心，离心条件：转速为80-120r/min，离心时间为10-15min，离心2-3次，得到叶绿素提取液以及经过脱色的混合藻液；

步骤5，将步骤4中经过脱色的混合藻液离心，离心条件：离心转速为1000-2000r/min，离心时间为10-15min，离心3-5次，取上清液，采用葡聚糖凝胶对上述上清液进行层析，洗脱液选用5-20mmol/L的盐酸提取液，经柱层析之后得到收集液，离心后所得藻泥在50-60℃下干燥得到藻干粉；

步骤6，将上述收集液进行合并，经过真空冷冻干燥之后，用超纯水对其进行溶解，采用脱盐柱对其进行层析，洗脱液采用超纯水，脱盐纯化1-4次，将所得的洗脱液用超滤膜进行超滤浓缩，浓缩后的滤液在-40--25℃下进行干燥得到金属硫蛋白。

2.根据权利要求1所述的基于小球藻的金属硫蛋白制备方法，其特征在于：

步骤1，将培养液置于反应器内，120℃下灭菌，放入小球藻藻种，再置于25℃光照培养箱中，培养12h，然后将反应器置于25℃无光照的培养箱中，培养5h，然后再放入有光照的培养箱中培养12h，如此重复8次，向处于对数生长期的小球藻中加入50μmol/L锌离子溶液，培养90h后，再向经过上述处理后的小球藻中加入70μmol/L铜离子溶液，再培养8天；

步骤2，培养8天后，将培养液以及其中的小球藻进行微孔滤膜浓缩，浓缩至原培养液体积的0.4％，膜浓缩参数：膜浓缩压力为0.07MPa，膜浓缩温度为25℃，得小球藻浓缩液；

步骤3，将步骤2中所得的小球藻浓缩液在常温下进行压力破壁，所述常温压力破壁的条件：破壁温度为25℃，破壁压力为450MPa，破壁时间为1.5h，得到破壁后的混合藻液；

步骤4，将步骤3中得到的破壁后的混合藻液用90％的乙醇溶液进行叶绿素的提取，提取温度为60℃，提取时间为6.5h，提取4次，提取后的混合液经过离心，离心条件：转速为100r/min，离心时间为12min，离心3次，得到叶绿素提取液以及经过脱色的混合藻液；

步骤5，将步骤4中经过脱色的混合藻液离心，离心条件：离心转速为1800r/min，离心时间为12min，离心4次，取上清液，采用葡聚糖凝胶对上述上清液进行层析，洗脱液选用12mmol/L的盐酸提取液，经柱层析之后得到收集液，离心后所得藻泥在56℃下干燥得到藻干粉；

步骤6，将上述收集液进行合并，经过真空冷冻干燥之后，用超纯水对其进行溶解，采用脱盐柱对其进行层析，洗脱液采用超纯水，脱盐纯化3次，将所得的洗脱液用超滤膜进行超滤浓缩，浓缩后的滤液在-35℃下进行干燥得到金属硫蛋白。

3.根据权利要求1或2所述的基于小球藻的金属硫蛋白制备方法，其特征在于：所述步骤1中的培养液的原料为2g/L的NaHCO₃、0.5g/L的KNO₃、0.02g/L的KH₂PO₄、0.3mg/L的V_B1和1.0μg/L的V_B12。

4.根据权利要求1或2所述的基于小球藻的金属硫蛋白制备方法，其特征在于：所述小球藻与所述培养液按照体积比为1:1-3的比例进行接种。

5.根据权利要求1或2所述的基于小球藻的金属硫蛋白制备方法，其特征在于：所述步骤1中的锌离子能够采用硫酸锌、氯化锌、葡萄糖酸锌中的一种或几种，铜离子能够采用硫酸铜、氯化铜、葡萄糖酸铜中的一种或几种。