[发明专利]基于小球藻的金属硫蛋白制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及金属硫蛋白制备技术领域，更具体地说涉及一种基于小球藻的金属硫蛋白制备方法。

背景技术

金属硫蛋白(metallothionein)是由微生物和动植物产生的金属结合蛋白，富含半胱氨酸的短肽，对多种重金属有高度亲和性。它是分子质量较低，半胱氨酸残基和金属含量极高的蛋白质。与其结合的金属主要是镉、铜和锌，广泛地存在于从微生物到人类各种生物中，其结构高度保守。

根据金属硫蛋白在化妆品、保健品和新医药等三个领域的应用发展情况，结合我国消费者的实际水平，以及新医药发展的步骤和速度，化妆品行业年需求20公斤左右，婴幼儿食品添加年需求10公斤左右，中老年保健食品年需求10-20公斤，新医药年需求20公斤左右，而产量为：2003年为6.8公斤，2004年为8.6公斤，2005年为9.5公斤，远远不能满足实际需求。2005年国内市场价：化妆品、保健品用300万元/公斤，医药用800-1000万元/公斤。2005年国外最新报价为82.50美元/毫克，273.7美元/5毫克。

目前国内采用的都是用兔肝生产金属硫蛋白，设备投入大，转让费高，而且产量低，难以满足现在市场对于金属硫蛋白的需求。

发明内容

本发明克服了现有技术中的不足，提供了一种基于小球藻的金属硫蛋白制备方法。

本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

基于小球藻的金属硫蛋白制备方法，按照下述步骤进行：

步骤1，将培养液置于反应器内，120℃下灭菌，放入小球藻藻种，再置于25℃光照培养箱中，培养12h，然后将反应器置于25℃无光照的培养箱中，培养5h，然后再放入有光照的培养箱中培养12h，如此重复3-10次，向处于对数生长期的小球藻中加入5-100μmol/L锌离子溶液，培养24-120h后，再向经过上述处理后的小球藻中加入5-100μmol/L铜离子溶液，再培养3-10天；

步骤2，培养3-10天后，将培养液以及其中的小球藻进行微孔滤膜浓缩，浓缩至原培养液体积的0.2-0.6％，膜浓缩参数：膜浓缩压力为0.05-0.09MPa，膜浓缩温度为25-30℃，得小球藻浓缩液；

步骤3，将步骤2中所得的小球藻浓缩液在常温下进行压力破壁，所述常温压力破壁的条件：破壁温度为25℃，破壁压力为300-500MPa，破壁时间为1-2h，得到破壁后的混合藻液；

步骤4，将步骤3中得到的破壁后的混合藻液用80-95％的乙醇溶液进行叶绿素的提取，提取温度为55-65℃，提取时间为5-7h，提取3-5次，提取后的混合液经过离心，离心条件：转速为80-120r/min，离心时间为10-15min，离心2-3次，得到叶绿素提取液以及经过脱色的混合藻液；

步骤5，将步骤4中经过脱色的混合藻液离心，离心条件：离心转速为1000-2000r/min，离心时间为10-15min，离心3-5次，取上清液，采用葡聚糖凝胶对上述上清液进行层析，洗脱液选用5-20mmol/L的盐酸提取液，经柱层析之后得到收集液，离心后所得藻泥在50-60℃下干燥得到藻干粉；

步骤6，将上述收集液进行合并，经过真空冷冻干燥之后，用超纯水对其进行溶解，采用脱盐柱对其进行层析，洗脱液采用超纯水，脱盐纯化1-4次，将所得的洗脱液用超滤膜进行超滤浓缩，浓缩后的滤液在-40--25℃下进行干燥得到金属硫蛋白。

优选的，基于小球藻的金属硫蛋白制备方法，按照下述步骤进行：

步骤1，将培养液置于反应器内，120℃下灭菌，放入小球藻藻种，再置于25℃光照培养箱中，培养12h，然后将反应器置于25℃无光照的培养箱中，培养5h，然后再放入有光照的培养箱中培养12h，如此重复8次，向处于对数生长期的小球藻中加入50μmol/L锌离子溶液，培养90h后，再向经过上述处理后的小球藻中加入70μmol/L铜离子溶液，再培养8天；

步骤2，培养8天后，将培养液以及其中的小球藻进行微孔滤膜浓缩，浓缩至原培养液体积的0.4％，膜浓缩参数：膜浓缩压力为0.07MPa，膜浓缩温度为25℃，得小球藻浓缩液；

步骤3，将步骤2中所得的小球藻浓缩液在常温下进行压力破壁，所述常温压力破壁的条件：破壁温度为25℃，破壁压力为450MPa，破壁时间为1.5h，得到破壁后的混合藻液；