[发明专利]G6PD过表达型ACHN稳转细胞株及其构建方法

权利要求书

1.一种G6PD过表达型ACHN稳转细胞株，其特征在于是一种G6PD过表达型ACHN稳转细胞株，是将pBABE-puro-G6PD转染人肾细胞腺癌细胞株ACHN，经嘌呤霉素加压筛选，Real-time PCR、Western blot验证，以及反复传代、冻存复苏所得的G6PD表达量稳定增加40倍以上的细胞株。

2.如权利要求1所述的G6PD过表达型ACHN稳转细胞株的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

一、G6PD基因的克隆

用Primer 5.0软件设计针对人G6PD基因的PCR正向引物5'-GGAATTCATGGCAGAGCAGGTGGCCCTG-3'和反向引物5'-ACGCGTCGACTCAGAGCTTGTGGGGGTTCAC-3'，分别引入EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点，以pMD19-Tsimple-G6PD-WT质粒DNA为模板，通过PCR扩增出G6PD的编码序列1548bp，纯化PCR产物，获得G6PD基因的cDNA；

二、pBABE-puro-G6PD重组表达载体的构建

上述G6PD基因cDNA的PCR纯化产物和pBABE-puro载体分别用EcoRⅠ和SalⅠ进行酶切，用TaKaRa的T4DNA连接酶进行连接，转化E.coli DH 5α，涂布平板，过夜培养；随机挑取2个单菌落进行扩增培养，提取质粒后进行EcoRⅠ和SalⅠ双酶切鉴定；对于酶切鉴定正确的质粒进行测序及序列的分析比对；扩增培养测序正确的阳性克隆，提取其不含内毒素的pBABE-puro-G6PD重组质粒；

三、ACHN细胞株的转染

复苏培养ACHN细胞至状态良好，转染前一天传代细胞至6孔板，每孔加入2×10⁵细胞，次日观察其汇合度为70％～80％时进行细胞转染；转染采用Lipofectamine 2000转染试剂和Opti-MEM培养基；6孔板每孔的转染量为4μg质粒稀释到250μL Opti-MEM培养基，得到A液，取10μL Lipofectamine 2000溶解于250μL Opti-MEM培养基，得到B液，室温孵育5min后将A液和B液混合，室温孵育20min后加入弃培养基的细胞中；孵育6～8hr后更换为新鲜不含抗生素的完全培养基；

四、ACHN-G6PD稳定细胞株的筛选及鉴定

细胞转染换液24hr后，更换完全培养基为含0.25μg/mL嘌呤霉素的筛选培养基，压力筛选一周，中间换一次液；一周后在倒置显微镜下观察，把单独每一个细胞群圈出，用0.25％胰酶消化画圈的细胞群，每一团细胞收集到新的24孔板的一个孔培养；继续用0.25μg/mL的嘌呤霉素压力筛选一周；倒置显微镜下观察，进行亚克隆筛选，挑选出正常生长细胞群传代，逐步放大培养；应用Real-time PCR、Western blot分别在mRNA和蛋白水平检测转染细胞株G6PD的表达水平，用紫外分光光度法在340nm检测G6PD酶活性；将稳转细胞株反复传代、冻存及复苏，观察其G6PD表达是否稳定；ACHN-G6PD细胞株已在体外传代20次以上，其G6PD表达量稳定增加40倍以上，G6PD酶活性增加2.2倍，表明G6PD过表达型ACHN稳转细胞株构建成功。