[发明专利]G6PD过表达型ACHN稳转细胞株及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及医学分子生物学相关技术，尤其是采用siRNA干扰技术构建细胞研究模型。

背景技术

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PD)广泛存在于生物体的各组织细胞中，是戊糖磷酸途径(pentose-phosphate pathway,PPP)的关键酶。G6PD基因定位于Xq2.8(NM_000402)，全长18kb，由13个外显子和12个内含子组成，其mRNA全长2395bp，cDNA为1548bp，编码515个氨基酸，单个亚基分子量为59kDa，有活性的G6PD以二聚体或四聚体状态存在。G6PD在催化葡萄糖6-磷酸(glucose-6-phophte,G-6-P)脱氢生成6-磷酸葡萄糖酸内酯的同时产生还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)。NADPH可维持细胞内还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)水平，在体内自由基和过氧化物清除过程中发挥着重要作用。PPP的另一重要产物为核糖5-磷酸(ribose-5-phosphate,R-5-P)，是合成核酸的基本原料。PPP其他中间产物，如果糖6-磷酸和甘油醛3-磷酸则可进入糖酵解(glycolysis)及三羧酸循环(tricarboxylic acid cycle,TAC)，继续氧化供能。

越来越多的研究表明，G6PD表达或者活性与多种肿瘤的发生发展关系密切。F Ohl等发现，G6PD基因在正常组织与膀胱癌组织细胞的转录存在明显差异，而且其mRNA的高低与肿瘤的恶性程度相关。YKekec以及JWang等的研究均表明，G6PD在胃癌组织中高表达，并且G6PD活性与肿瘤的恶性程度呈正相关。白血病患者的红细胞中G6PD呈现高表达和高活性。Wei-yingK等报道，G6PD高表达的NIH 3T3细胞呈现升高的NADPH和GSH，伴随着细胞增殖异常、诱发裸鼠成瘤能力增强等特点。联合运用G6PD抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖(deoxy-D-glucose,2-DG)和6-氨基烟酰胺(6-aminonicotinamide,6-AN)可增加人神经胶质瘤及鳞状细胞癌细胞系对放射性治疗的敏感性，改善疗效。我们先前的研究亦表明，G6PD过表达在人恶性黑色素瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。应用siRNA-慢病毒载体靶向敲低人皮肤黑色素瘤A375细胞内源性G6PD表达，构建G6PD缺陷的A375细胞(A375-G6PD△)，并发现A375-G6PD△细胞呈现生长增殖抑制，肿瘤形成能力降低，凋亡率升高，对巯基氧化剂二酰胺诱导的氧化应激更敏感。然而，迄今为止，G6PD在肿瘤发生、发展过程中的分子机制尚未阐明，有待进一步研究。

肾癌又称肾细胞癌，是泌尿系统中恶性程度较高的肿瘤，约占成人肾脏恶性肿瘤的80％～90％，占成人恶性肿瘤的2％～3％。世界范围内各国或各地区的发病率各不相同，总体上发达国家发病率高于发展中国家，城市高于农村，男性多于女性，男女患者比例约为2:1，发病年龄可见于各年龄段，高发年龄50～70岁。据统计，目前我国肾癌发病率正呈逐年上升趋势，且肾癌的病因未明。虽然外科手术是公认的肾癌治疗手段，但约有1/3肾细胞癌患者在初诊时已有远处转移，术后约有1/2病人在一定时间内将出现转移。此外，肾细胞癌对绝大部分放化疗以及生物治疗十分不敏感。因此，明确肾细胞的发病机制，寻找有效的化学、免疫等辅助疗法对改善肾细胞癌的预后，成为亟待解决的问题。

本发明人采用免疫组化方法已经证实，G6PD在人肾细胞腺癌组织中表达量比癌旁正常组织高，差异有统计学意义。但是G6PD表达或者活性变化与肾细胞癌发生发展的关系及其机制又是怎样的呢？目前国内外尚无相关报道。

发明内容

本发明旨在提供一种G6PD过表达型ACHN稳转细胞株，作为细胞模型用于研究G6PD与肾细胞癌的相关性及其作用机制。

本发明所述的G6PD过表达型ACHN稳转细胞株是一种G6PD过表达型ACHN稳转细胞株，是将pBABE-puro-G6PD转染人肾细胞腺癌细胞株ACHN，经嘌呤霉素加压筛选，Real-time PCR、Western blot验证，以及反复传代、冻存复苏所得的G6PD表达量稳定增加40倍以上的细胞株。

本发明所述的G6PD过表达型ACHN稳转细胞株的构建方法包括以下步骤：

一、G6PD基因的克隆