[发明专利]设计核酸及其使用方法

说明书

本申请是申请日为2011年10月3日，题为“设计核酸及其使用方法”的中国专利申请201180057555.4的分案申请。

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年10月1日提交的美国临时申请61/404,413的优先权，其公开的内容视为本申请公开内容的一部分(并在此通过引用而全文引入)。

背景技术

天然存在的RNA是由四种基本的核糖核苷酸ATP、CTP、UTP和GTP合成的，但也可以含有转录后修饰的核苷酸。而且，在RNA中已经鉴定出大约100种不同的核苷修饰(Rozenski，J，Crain，P，和McCloskey，J(1999)。RNA修饰数据库：1999年更新，Nucl Acids Res 27:196-197)。但是，在免疫刺激潜能和RNA翻译效率方面，核苷修饰所起的作用尚不明了。

影响蛋白质表达的现有方法学中存在许多问题。例如，引入细胞的异源DNA(不论异源DNA是否整合入染色体)可能由子代或后代细胞遗传。引入的DNA可以以某种频率整合入宿主细胞的基因组DNA，从而改变和/或破坏宿主细胞的基因组DNA。此外，在产生蛋白质之前必须经过多个步骤。一旦进入细胞，DNA必须转运到细胞核中，在细胞核内转录成RNA。之后从DNA转录的RNA必须进入细胞质，在细胞质内翻译成蛋白质。对多个处理步骤的需求导致了在感兴趣的蛋白质产生之前的时间延滞。此外，在细胞内实现DNA的表达存在困难；经常地，DNA进入细胞但没有表达，或者没有以合理的速度或浓度表达。将DNA引入诸如原代细胞或修饰的细胞系的细胞时，这可能尤其是个问题。

本领域需要解决核调节酸细胞内翻译的生物学模式。

除非另有解释，否则在本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域普通技术人员通常的理解具有相同的含义。尽管，类似于或等同于本文所述的方法和材料也可用于本发明的实施和检测，但在此描述了适合的方法与材料。材料、方法和实施例仅为示例性的，而非旨在限制。本发明其他特征可以自以下发明详述和权利要求明显看出。

发明简述

本文描述了生产蛋白质、多肽和肽的方法。例如，所述方法包括在所述感兴趣的蛋白质、多肽或肽在细胞内产生(例如，翻译)的条件下，将编码感兴趣的蛋白质、多肽或肽的核酸(例如，本文所述的修饰核酸)引入细胞(例如，人细胞)。在一些具体实施方式中，所述核酸包含一个或多个核苷修饰(例如，一个或多个本文所述的核苷修饰)。在一些具体实施方式中，所述核酸能逃脱该核酸所引入的细胞的天然免疫反应。在一些具体实施方式中，所述蛋白质、多肽或肽是本文所述的治疗性蛋白质。在一些具体实施方式中，所述蛋白质、多肽或肽包含一个或多个翻译后修饰(例如，人细胞中存在的翻译后修饰)。本文还描述了用以生产蛋白质的组合物和试剂盒。本文进一步描述了具有(例如，通过本文所述的方法产生的)改变的蛋白质水平的细胞和培养物。

一方面，本发明涉及在细胞内生产感兴趣的蛋白质(例如，异源蛋白质)的方法，所述方法包括步骤：(ⅰ)提供能进行蛋白质翻译的靶细胞；以及(ⅱ)在所述感兴趣的蛋白质在靶细胞内生产的条件下，向靶细胞内引入包含第一分离的核酸的组合物，所述第一分离的核酸包含编码感兴趣的蛋白质的可翻译区和核苷修饰。在一些实施方式中，所述方法进一步包括从细胞中充分纯化感兴趣的蛋白质的步骤。在一些实施方式中，所述感兴趣的蛋白质是分泌蛋白。

另一方面，本发明涉及在细胞内生产感兴趣的蛋白质(例如，异源蛋白质)的方法，所述方法包括步骤：(ⅰ)提供能进行蛋白质翻译的靶细胞，以及(ⅱ)在所述感兴趣的蛋白质在细胞内产生的条件下，向靶细胞内引入组合物，所述组合物包含：(a)包含编码感兴趣的蛋白质的可翻译区和核苷修饰的第一分离的核酸；和(b)包含抑制性核酸的第二核酸。在一些实施方式中，所述方法进一步包括从细胞中充分纯化感兴趣的蛋白质的步骤。在一些具体实施方式中，所述感兴趣的蛋白质是分泌蛋白。

一方面，本发明涉及提高细胞内感兴趣的重组表达蛋白质的产量的方法，包括步骤：(ⅰ)提供包含编码感兴趣的蛋白质的重组核酸的靶细胞；和(ⅱ)在效应蛋白(effector protein)在靶细胞内生产的条件下，向靶细胞引入含有第一分离的核酸的组合物，从而提高细胞内重组表达蛋白的产量，所述第一分离的核酸包含编码翻译效应蛋白的可翻译区和核苷修饰。