[发明专利]一种D型β-葡萄糖苷酶突变体及其表达质粒和重组菌

说明书

技术领域

本发明涉及一种D型β-葡萄糖苷酶突变体及其表达质粒和重组菌，具体涉及的是一种酶活性显著提高的D型β-葡萄糖苷酶突变体及其表达质粒和重组菌，属于生物工程技术领域。

背景技术

D型β-葡萄糖苷酶（β-D-吡喃葡萄糖苷水解酶，E.C. 3.2.1.21）是一类能水解苷类和寡糖的糖苷键并释放非还原性末端葡糖残基的酶。这些酶普遍存在于所有领域的生命体中，在古细菌、真细菌和真核生物中发挥多种功能和作用。包括微生物内的生物质转换、动物体糖脂和外源性糖苷的降解、细胞壁寡糖的木质化和分解代谢、防御、植物激素结合共轭激活作用、植物中气味释放以及植物-微生物和植物-昆虫相互作用等。

白蚁是自然界中纤维素的最主要消耗者，白蚁主要通过内源和外源纤维素酶的协同作用分解纤维素，最终转化为葡萄糖。白蚁体内就是一个微型的生物发酵器，若能模拟白蚁的纤维素酶降解系统，工业化纤维素-葡萄糖-酒精-燃料的生产体系必是解决当前环境问题能源危机的一条重要途径。

至今，国内外对白蚁体内的内源性D型β-葡萄糖苷酶的研究已经逐步加深，目前人们主要集中在对该酶进行结构功能研究，并通过改造获得高表达、高活性的D型β-葡萄糖苷酶用于工业经济应用(Zhang, et al., 2010)。目前已有的研究显示，该类纤维素水解酶的催化效率较低、人工提取和表达的酶纯化难度较大，若能通过同源建模等手段进行理性分子设计，对白蚁内源性D型β-葡萄糖苷酶蛋白的催化活性、稳定性、底物特异性、耐热性和耐酸碱性等进行合理化改造，将使此类酶具有更大的应用前景，实现巨大工业经济价值。Hsiao-lin Lee等人（Mutations in the substrate entrance region of β-glucosidase from Trichoderma reesei improve enzyme activity and thermostability）已经在来源于里氏木霉的β-葡萄糖苷酶中研究了突变后的酶，获得了一些活性增强的突变体。

本发明从台湾家白蚁的cDNA中克隆得到D型β-葡萄糖苷酶CfBG Glu1D,根据蛋白质结构预测和同源性序列分析，找出了一系列突变位点，在这些氨基酸位点上进行点突变，得到了一系列突变体酶。经过蛋白质表达与验证，发现有几个突变体酶的催化活性显著增强。

发明内容

本发明的目的是提供一种酶活性提高的D型β-葡萄糖苷酶突变体。本发明通过基因工程手段对D型β-葡萄糖苷酶进行基因体外克隆和定点突变，然后将含有突变点基因的重组质粒转化进入大肠杆菌宿主细胞中进行表达，得到5个酶活性显著提高的D型β-葡萄糖苷酶突变体。

所述亲本D型β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

突变体的表示方法为：Glu1D- 原始氨基酸-位置-替换的氨基酸

所述突变体是将第182位的酪氨酸Y分别变为色氨酸W、亮氨酸L；第194位的甲硫氨酸M分别变为亮氨酸L、苯丙氨酸F；第244位的天冬氨酸D变为组氨酸H。分别表示为Glu1D- Y182W、Glu1D- Y182L、Glu1D- M194L、Glu1D- M194F、Glu1D- D244H。

本发明的另一目的是提供一种包含有D型β-葡萄糖苷酶突变体DNA序列的突变质粒；

本发明的另一目的是提供一种含有上述突变质粒的重组突变菌株。

所述突变体构建的具体步骤如下：

（1）    突变体表达菌株的构建

本发明从实验室饲养的台湾家白蚁的唾液腺和肠道组织中，提取出RNA，

经过反转录，得到cDNA。

依据NCBI基因数据库中的台湾家白蚁的β-葡萄糖苷酶基因（GenBank 登录号为JN565080），根据序列同源性，设计扩增引物，以得到的白蚁cDNA为模板进行PCR扩增，加上限制酶Hind III和Xho I的酶切位点，PCR扩增后的产物插入到载体pET-28a（Novagen公司）上的相应多克隆位点之间，转化入Ecoli.DH5α（Novagen公司）感受态细胞中，筛选转化子，测序后与已有的序列（JN565080）比对，不完全相同，将本实验室得到的此重组质粒称为pET-28a-Glu1D。

将重组质粒pET-28a-Glu1D转化入Ecoli.BL21(DE3)（Novagen公司）进行表达，得到的β-葡萄糖苷酶称为D型β-葡萄糖苷酶(CfBG Glu1D)。