[发明专利]用于检测肺炎支原体的靶序列及检测试剂盒

说明书

本发明提供了用于检测肺炎支原体的靶序列及检测试剂盒。本发明首先通过对肺炎支原体基因测序和比对，筛选得到用于检测肺炎支原体的多拷贝重复序列基因，其序列如SEQ ID NO.1所示，并设计了检测其的实时荧光定量PCR引物和探针，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4所示。本发明的检测试剂盒检测肺炎支原体灵敏度可低至0.2 CFU，对临床常见23种呼吸道病原体均无非特异扩增，显示出良好的特异度，具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有良好的标本检测能力。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测肺炎支原体的靶序列、荧光定量PCR引物和探针，本发明还涉及利用该靶序列进行肺炎支原体检测的方法和试剂盒。

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)是引起人类呼吸道感染的重要致病菌之一，每年约有10％-40％的社区获得性肺炎是由其感染所引起的。由于缺少快速灵敏的检测技术及检测试剂盒，目前国内临床对于肺炎支原体的诊断能力有限，误诊和漏诊现象普遍存在，给医疗负担和医患关系带来负面效应。目前，荧光PCR检测技术凭借其快速、高灵敏度和特异度的优势，越来越广泛的应用于临床肺炎支原体感染检测。国内外已报道多种肺炎支原体荧光PCR检测体系，检测灵敏度和特异度均已经超过传统的血清学检测和普通PCR检测技术，荧光PCR检测技术逐渐成为临床肺炎支原体检测的“金标准”。目前报道的检测肺炎支原体的荧光PCR检测的基因主要有ATPase operon gene(参考文献：Daxboeck,F.,G.Khanakah,C.Bauer,M.Stadler,H.Hofmann,and G.Stanek.2005.Detection ofMycoplasma pneumoniae in serum specimens from patients with mycoplasmapneumonia by PCR.Int.J.Med.Microbiol.295:279-285.)，P1基因(参考文献：ZHAO Fei,CAO Bin,HE Li Hua,YIN Yu Dong,TAO Xiao Xia,SONG Shu Fan,MENG Fan Liang,andZHANG Jian Zhong.2012.Evaluation of a new real-time PCR assay for detectionof Mycoplasma pneumoniae in clinical specimens.Biomed Environ Sci.25:77-81.)和CARDS toxin gene(参考文献：Winchell,J.M.,K.A.Thurman,S.L.Mitchell,W.L.Thacker,and B.S.Fields.2008.Evaluation of three real-time PCR assays fordetection of Mycoplasma pneumoniae in an outbreak investigation.J.Clin.Microbiol.46:3116-3118.)，上述现有技术报道的检测肺炎支原体的检测灵敏度在几十CFU到几个CFU之间。

目前报道的检测方法是通过对多株肺炎支原体相关目的基因进行序列比对，在上述目的基因的保守区域中设计引物探针的检测方法。由于上述ATPase operon、P1、CARDStoxin等基因在肺炎支原体基因组中均为单一拷贝，也就是说每个肺炎支原体菌中只含有1个靶序列作为检测的扩增模板。另一方面，研究发现肺炎支原体菌株中存在许多重复序列(包括RepMP1 a-n，RepMP23 a-j，RepMP4 a-h，RepMP5 a-j)，这些重复序列在肺炎支原体中都是多拷贝。理论上说，以多拷贝重复序列基因作为靶序列检测可将相同条件下荧光PCR检测灵敏度相应提高几倍至十几倍。但是目前由于肺炎支原体的这些重复序列并非完全一致，只是部分序列一致，且重复序列的稳定性也没有通过大量的测序数据进行验证。因此，对于重复序列中寻找保守且稳定的靶序列，并设计探针引物存在巨大困难。