[发明专利]双羰基还原酶突变体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及酶及酶工程领域，具体而言，涉及一种双羰基还原酶突变体及其应用。

背景技术

酶作为生物催化剂，在生物体内能充分发挥其高效和高特异性的特点。但是在工业应用中，却普遍存在无法适应工业生产条件和对非天然底物的催化能力低等问题。必须借助蛋白质工程方法对酶分子进行改造以适应不同的应用要求。蛋白质工程方法可以概括为三种：理性设计(rational design)、非理性设计(irrational design)和半理性设计(semi-rational design)。

理性设计是指在了解蛋白质的空间结构的基础上，通过定点突变(Site-directed Mutagenesis)或其它方法改变蛋白质分子中的个别氨基酸，从而产生新性状的蛋白质。这种方法在理论上针对性较强，主要用于改造天然酶蛋白的催化活性、底物特异性、稳定性、改变抑制剂类型、辅酶特异性等方面。

定点饱和突变技术是蛋白质工程中的一门重要技术，属于上述的半理性设计但又结合了理性设计和非理性设计的优点，弥补了各自的不足，它通过对目的蛋白的编码基因进行改造，短时间内获取靶位点氨基酸分别被其它19种氨基酸替代的突变体。此技术不仅是蛋白质定向改造的强有力工具，而且是蛋白质结构－功能关系研究的重要手段。研究表明，多点突变往往能获得比单点突变更为理想的进化体。多点突变是定点突变不易直接获得的。而对于定点突变技术不能解决的这些问题，恰恰是定点饱和突变技术所擅长的独特之处。

羰基还原酶是一种氧化还原酶，在生物有机体的许多生物转化过程中发挥重要作用。基于其能催化产生高对应选择性的手性醇，羰基还原酶通常作为一种非常重要的生物催化剂应用于化学和制药工业中手性中间体的合成。而双羰基还原酶能够立体选择性地将二酮酸酯的两个羰基同时还原为相应羟基，可以用于合成关键的药物中间体，尤其是合成他汀类药物的手性二羟基己酸链，如世界上畅销的降胆固醇药物阿托伐他汀(Atorvastatin，立普妥)和瑞舒伐他汀(Rosuvastatin)。

目前已知的双羰基还原酶可以作为生物催化剂，一步还原二酮底物，制备得到近乎单一光学纯度的他汀类降血脂药物关键手性中间体3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸叔丁酯，简化了合成步骤，降低了生产污染。但是在工业生产的应用中，依然有一些问题需要进一步解决，如酶催化活性较低，使酶液的用量较大，且使反应体系总体积增加，导致了生产批次和生产成本的增加。

因此，仍需要对现有的双羰基还原酶进行改进，以提高双羰基还原酶(DKR)的酶立体选择性和催化活性。

发明内容

本发明旨在提供一种双羰基还原酶突变体及其应用，以提高双羰基还原酶(DKR)的酶 立体选择性和催化活性。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种双羰基还原酶突变体，该双羰基还原酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：9所编码的氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，发生突变的氨基酸序列具有如下至少两个突变位点：第94位、第151位、第231位、第236位和第251位，且第94位的I突变为V、A或G；第151位的V突变为Q、N或S；第231位的F突变为W、Y或P；第236位的I突变为L、V或A；第251位的Q突变为H、R或K；或者双羰基还原酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有90％以上同源性的氨基酸序列。

进一步地，双羰基还原酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或者SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列；或者双羰基还原酶突变体的氨基酸序列为与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或者SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列具有95％以上同源性的氨基酸序列。

根据本发明的另一方面，提供了一种DNA分子，DNA分子编码上述任一种双羰基还原酶突变体。