[发明专利]一种志贺氏菌的分子检测方法及其应用

权利要求书

1.一种非疾病诊断目的的志贺氏菌的分子检测方法，其特征在于，采用单引物等温扩增方法，以志贺氏菌ipaH基因特异序列为靶序列，SYBR GreenⅡ为荧光染料，实时荧光检测仪检测扩增的实时荧光信号，其具体过程包括如下步骤：

（1）取含志贺氏菌的待检样品，提取基因组DNA；

（2）建立志贺氏菌的实时荧光单引物等温扩增25 μL反应体系：

RNA/DNA组合引物 5.6μmol/L、Blocker 0.36μmol/L、10×Bst Buffer 2.5μL、Bst DNA polymerase 20U、10×RNaseH Buffer 2.5μL、RNaseH 5U、dNTPs 0.2 mmol/L、MgCl₂3.5mmol/L、RNase Inhibitor 16U、DNA模板1μL、SYBR GreenⅡ0.3μL，其余用灭菌DEPC水补足体系；

所述SYBR GreenⅡ为300倍稀释；

将DNA模板、组合引物、Blocker及反应缓冲液的混合液经99℃，90s处理后降温至60℃，迅速加入RNase H和Bst DNA聚合酶，在实时荧光定量PCR仪上58℃ 反应40min，反应过程中实时监测荧光信号；

（3）检测分析：分析检测数据，

所述引物为GCUUAGUGA-TTTGATGGTGTC，5’端9nt合成为RNA序列，3’端12nt合成为DNA序列；所述Blocker为TTAGATAATGTGGTA，3’端用生物素修饰，中间随机加上五个锁核酸XNA修饰，所述XNA为A、C、G、T、U或mC六种碱基中的一种。

2.根据权利要求1所述的一种非疾病诊断目的的志贺氏菌的分子检测方法，其特征在于，步骤（1）所述的提取基因组DNA方法采用普通热裂解法、蛋白酶K法、饱和酚法或水洗法结合商业化试剂盒法。

3.根据权利要求1所述的一种非疾病诊断目的的志贺氏菌的分子检测方法，其特征在于，所述提取基因组DNA方法采用商业化试剂盒法。

4.根据权利要求1所述的一种非疾病诊断目的的志贺氏菌的分子检测方法，其特征在于，步骤（2）在实时荧光定量PCR仪上反应，循环数为80个循环，每次循环30s。

5.一种权利要求1-4任一项所述的分子检测方法在食品中志贺氏菌检测的应用。