[发明专利]一种志贺氏菌的分子检测方法及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种志贺氏菌的分子检测方法及其应用。

背景技术

志贺氏菌（Shigella）是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌，通称痢疾杆菌，是一类具有高度传染性和危害严重的革兰氏阴性杆菌，长约2～3μm，不形成芽胞，无荚膜，无鞭毛，有菌毛。志贺氏菌病常为食物爆发型或经水传播，人类对志贺氏菌普遍易感，每年全球有1.6亿人患病，约有110万人死亡，绝大多数为5岁以下儿童，10～100 cfu细菌即可致病。在发展中国家，由福氏志贺氏菌引起的感染性腹泻疾病高居首位。中国自2005 年开始，在全国范围内开展菌痢的监测，该病的报告病例数一直高居全国甲乙类法定传染病的前5位。

目前食品中志贺氏菌的传统检测方法主要依据国家标准GB 4789.5-2012，需要厌氧培养、分离、筛选和生化鉴定，检测结果虽准确，但操作繁琐、检测周期长，满足不了快速检测的需求。分子生物学技术因具有检测灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，在食源性致病菌的检测中发挥了巨大的作用，也被应用于志贺氏菌的检测。随着食品安全检测标准的提高，寻找更加快速、准确、便捷的检测技术显得至关重要。

根据 Igor G 等（Igor G, Anders S, Alexander M, et al. A method for allelic replacement in Francisella tularensis [J]. FEMS microbiology letters,2003,222(2): 273-280）研究，只要10 CFU～100 CFU的志贺氏菌就可通过感染肠道而致病，引发严重的炎症反应；在幼儿可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。因此检测志贺氏菌的方法是否灵敏、特异及快速至关重要。吴平芳等（吴平芳,石晓路,郑琳琳,扈庆华,李庆阁,张佳峰,庄志雄,刘小立,张顺祥,王冰,贺连华,林一曼.PCR快速检测食品中志贺氏菌方法的建立[J].中国卫生检验杂志,2006,16,(4):394-395.）建立的改良分子信标-实时PCR反应体系DNA灵敏度为93 fg/μL，对菌液灵敏度为64 CFU/mL，或2 CFU/PCR反应体系，且无交叉反应。胡建华（胡建华，李洁莉，马兆飞，陆玲. 牛奶样品中志贺氏菌的快速PCR 检测技术研究[J]. 食品科学, 2007, 28(8):433-437.）采用快速常规PCR和定量实时PCR结合，对培养液中及牛奶阳性样品中的志贺氏菌进行检测，检测敏感度可达到2 CFU/ml，检出时间小于20h。徐义刚（徐义刚,崔丽春,张昕哲,等. 志贺氏菌属环介导恒温扩增快速检测方法的建立及初步应用[J]. 中国预防兽医学报,2010,9: 691-694.）对志贺氏菌纯培养菌的LAMP检测灵敏度为28 CFU/mL，对污染食品中志贺氏菌的检测灵敏度为35 CFU/mL。曾桂芬等（曾桂芬,龙北国,姜容,等. LAMP和PCR法检测痢疾志贺菌的特异性和灵敏性比较[J]. 热带医学杂志, 2012,12(5):547-549.）检测细菌纯培养物和模拟食品的灵敏度LAMP法分别为5.3×10¹CFU/ml、6.8×10¹CFU/ml。

单引物等温扩增技术（Single primer isothermal amplification，SPIA）是近年报道的一种新型线性核酸等温扩增技术。该技术具有操作设备简单、高忠实性、高效率和有效防污染等优点。目前应用较成熟的单引物等温扩增技术均以病毒作为对象，其扩增后的检测方法为聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用此种方法检出的灵敏度低，易产生沉淀，且结果假阳性高，尤其不适应于原核微生物的扩增检出。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简单、耗时短、特异性强、灵敏度高且便于实时监控的志贺氏菌的分子检测方法，本发明还提供所述分子检测方法的应用。

本发明解决其技术问题采用的技术方案为：一种志贺氏菌的分子检测方法，采用单引物等温扩增方法，以志贺氏菌ipaH基因特异序列为靶序列，SYBER GreenⅡ为荧光染料，实时荧光检测仪检测扩增的实时荧光信号，其具体过程包括如下步骤：

（1）取含志贺氏菌的待检样品，提取基因组DNA；

（2）建立志贺氏菌的实时荧光单引物等温扩增25 μL反应体系：