[发明专利]一种获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记的方法及应用

权利要求书

1.一种获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记的方法，该方法包括：

1）辣椒转录组测序：利用辣椒高抗和高感疫病材料杂交获得F₁，F₁自交获得F₂，对F₂群体进行辣椒疫霉菌接种，分别采集F₂群体接种0天和5天后的样品备用；接种辣椒疫霉菌10天后，调查F₂群体发病情况，分别选取15株辣椒高抗和高感疫病单株构建辣椒疫病抗、感基因池，命名为KC0（抗池对照）、KC5（接种5天后的抗池）、GC0（感池对照）和GC5（接种5天后的感池），利用测序仪器对抗、感池分别进行转录组测序；

2）差异基因表达分析：利用生物信息学软件对4个辣椒疫病抗、感基因池的测序数据进行合并组装，首先将各样品数据进行低质量过滤，使Q20达到99%以上，再将过滤后各样品数据合并在一起根据相似度进行聚类，在聚类单元中选取最长的序列作为Unigene序列，完成Unigene库的构建，利用RPKM值反映对应Unigenes的表达丰度，再利用生物信息学软件EBSeq筛选出在辣椒疫病抗、感基因池之间差异表达的基因；

3）差异基因功能注释：在NCBI网站上使用Blastn、Blastp和InterProscan软件对筛选到的差异表达基因进行数据库比对，获得差异表达基因的注释信息和蛋白质功能预测结果，根据注释信息和蛋白质功能预测结果进一步筛选出与辣椒疫霉病抗性相关的差异表达基因；然后利用上述差异表达基因片段，在辣椒全基因组数据库（http://peppergenome.snu.ac.kr和http:// peppersequence.genomics.cn）中进行Blastn比对，获得差异表达基因即辣椒疫病抗性相关基因完整的开放阅读框（ORF）；

4）SNP位点的鉴定：针对所获得的辣椒疫病抗性相关基因ORF的序列特征，利用生物信息学软件设计特异引物；对辣椒高抗疫病和高感疫病材料进行扩增，扩增产物经琼脂糖电泳后，回收、克隆并测序；利用生物信息学软件DNAman对高抗和高感疫病辣椒材料的扩增产物进行序列比对，找出辣椒疫病抗性相关基因序列在高抗和高感疫病辣椒材料中存在的SNP位点；

5）辣椒疫病抗性候选基因的获得：针对辣椒疫病抗性相关基因序列在辣椒高抗和高感疫病材料中所鉴定到的SNP位点特征，利用生物信息学软件设计特异SNP引物对高抗和高感辣椒疫病材料以及高抗和高感疫病材料杂交、自交获得的F₂群体进行扩增，同时对高抗、高感以及F₂群体进行辣椒疫霉菌接种，10天后调查发病情况；最后，SNP标记扩增结果结合上述材料的疫霉菌接种鉴定结果，筛选到只在高抗材料中扩增出条带，而在感病材料中无扩增条带的引物，此类引物对应的基因即为辣椒疫病抗性候选基因。

2.权利要求1所述的一种获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记的方法的应用，其特征在于包括：

1）辣椒疫病抗性候选基因及分子标记的方法为先进行辣椒疫病转录组测序找到差异表达

基因，再进行差异表达基因的功能注释以及蛋白质功能预测，找到与其他作物疫病抗性基因

同源性较高的辣椒疫病抗性相关基因，再根据抗性相关基因设计引物，在不同辣椒抗、感疫

病材料中扩增，比对序列差异，发现存在与抗、感辣椒疫病材料中的SNP位点，再根据SNP

位点特征设计特异进行引物的有效性验证，最后获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记；

2）用于辣椒转录组测序样品为高抗和高感辣椒疫病材料杂交、自交获得的F₂群体经接

种辣椒疫霉菌0-5天抗之内的抗、感基因池；

3）获得的5个辣椒疫病抗性候选基因分别为CARpi-1，CARpi-2，CARpi-3，CARpi-1，CARpi-4和CARpi-5，5个基因对应的在2个辣椒全基因组数据库中对应的ID号分别为CA00g85670、CA11g14390、CA03g00800、CA10g12800和CA11g04330（http://peppergenom e.snu.ac.kr）和Capana02g001506、Capana11g000418、Capana03g004163、Capana10g001567和Capana11g001783（http://peppersequence.genomics.cn）；

4）利用辣椒疫病抗性候选基因开发的SNP分子标记用于辣椒疫病抗性育种材料的选育。