[发明专利]一种获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记的方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于辣椒生物技术领域，具体涉及一种获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记的方法及应用，主要通过辣椒疫病转录组测序、差异基因表达分析和功能注释、基因组DNA提取、PCR扩增、扩增序列差异分析和SNP位点鉴定、SNP引物设计及有效性验证，进而获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记，该方法适用于辣椒疫病抗性基因鉴定及分子标记辅助选择育种。

背景技术

辣椒(Capsicum spp.)是世界上最重要的蔬菜作物之一，品种多，产量高，营养丰富，用途广泛，在人们的日常生活中具有重要的作用。在中国，辣椒种植业经过几十年的发展，已经成为我国第二大蔬菜作物，据联合国粮农组织的统计数据显示，2012年我国辣椒年播种面积为75万公顷，年产鲜椒和干椒1631万吨，播种面积和产量均居世界首位。目前，辣椒已成为我国设施栽培中重要的经济作物之一，在重点产区已经成为当地种植业中农民增收的支柱产业。

但生产中诸多不利因素(如生物胁迫和非生物胁迫)，制约了辣椒种植业的发展。目前，疫病(Phytophthora capsici Leon)已成为我国辣椒生产上的最重要病害，分布极为广泛，危害十分严重。辣椒疫病是由疫霉菌引起的真菌性病害，自1918年在美国新墨西哥首次报道之后，我国也于20世纪50年代在江苏发现，至今疫病几乎蔓延至全国各辣椒主产区，且有逐年加重的趋势，每年引起的产量损失高达30％～80％。由于辣椒疫病发生的普遍性和所引起病害的严重性，而且传播途径多样，病害发生常呈现暴发性，导致生产上还没有出现有效防治疫病的方法。因此，加强疫病的防治对于保证辣椒稳产、高产有着重要的作用。

为了有效的防治辣椒疫病的发生，选择抗病品种是一种最经济、安全、可靠的方法。但采用传统育种手段进行优良辣椒抗病品种的选育，存在工作量大、育种周期长、选择效率较低等缺点，而随着农业生物技术的快速发展，借助分子标记辅助选择技术可以大大提高育种效率。目前，国内外研究者已经定位了多个辣椒疫病抗性性状QTL位点和鉴定出一个抗病相关基因CaRGA2，并在此基础上开发了相关分子标记，如D₀₄SCAR、SSR-9、P5-SNAP和RGA-STS₁₂₀₀等。但由于不同研究者所利用的抗、感材料和疫霉菌菌株不完全相同，使得获得的这些QTL并不能得到相互佐证，而基于QTL和抗病相关基因开发的相关分子标记由于连锁性不够紧密以及标记自身的特征使其有效性和通用性并不高，一定程度上制约着辣椒疫病抗性品种的选育进程。

如何快速、有效的鉴定获得辣椒疫病抗性候选基因，开发基于基因本身序列特征的分子标记，是开展辣椒疫病抗性基因克隆及分子标记辅助选择育种的前提，对于开展辣椒疫病抗性基因工程育种具有重要的作用。转录组测序(RNA-Seq)是指利用高通量测序技术对组织或细胞中所有的mRNA反转录的cDNA进行测序，全面快速地获得某一物种特定组织在某一状态下的所有转录本。RNA-Seq技术最重要的一个应用就是它能对所有检测到的基因进行表达量的分析，可以分析不同样品转录组基因的表达差异，所以能更加准确和高效的大量发现低丰度表达的新基因，目前已在多种作物中被应用于新基因挖掘研究。

随着测序技术的不断发展，目前辣椒全基因组测序工作已完成，相应的测序数据也已公布。而通过辣椒接种疫霉菌后的转录组数据分析，结合辣椒全基因组数据信息，为辣椒疫病抗性候选基因鉴定奠定了良好的科研基础。因此，通过转录组和基因组数据信息，利用生物信息学技术开展辣椒疫病抗性候选基因的挖掘及鉴定研究，开发基于抗性基因自身序列特点的特异性分子标记，进而用于辣椒疫病分子标记辅助选择育种，可以改变目前辣椒疫病相关分子标记有效性和通用性不高以及抗性相关基因鉴定严重不足的现状，将大大提高辣椒疫病抗性品种的选育效率。

发明内容

解决的技术问题：本发明的目的是通过利用辣椒转录组和基因组数据信息，结合生物信息学和分子生物学技术获得辣椒疫病抗性候选基因及分子标记的方法及应用。该方法可以精准地挖掘到辣椒疫病抗性候选基因，可进一步用于辣椒疫病抗性候选基因功能验证以及分子标记辅助选择育种，加快辣椒育种进程，同时也可以为其他作物的抗病候选基因鉴定及分子标记开发研究提供参考。