[发明专利]一种鞣酸加压素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物制药领域。更具体地，本发明涉及鞣酸加压素的制备方法。

背景技术

鞣酸加压素，是由九个氨基酸残基组成的合成多肽，其化学结构为L-Cys-L-Tyr-L-Phe-L-Gln-L-Asn-L-Cys-L-Pro-L-Arg-L-Gly(1→6)-二硫键鞣酸盐，加压素的理论分子量1084.24。鞣酸加压素为抗利尿激素药，能促进远端肾小管及集合管对水分的重吸收而具有抗利尿作用，其制剂临床用于治疗尿崩症。

目前已上市多肽药物常见的纯化方法大都采用了制备型高效液相色谱法，该法是获得高纯度多肽目标分子的最有效的方法。一般多肽药物纯化制备工艺设计是先中低压色谱富集目标多肽，然后高压色谱精制，但是考虑到我们目标多肽血管紧张素分子量约1kD，无合适的分子筛凝胶柱(其上样量小，流速低，处理量小，比较适合分子量大于10kD蛋白的脱盐)或超滤膜选择。而且中低压色谱中常用的分离方法有分子筛色谱法、离子交换色谱法和疏水相互作用色谱法，这些色谱方法中用到的填料的粒径通常从几十微米到几百微米不等，空隙尺寸多为几百纳米不等，无法得到高纯度的目标多肽。如果采用高盐洗脱，后期处理无法找到合适的脱盐方案，分离纯化效果也有限，样品损失很大，回收率计算也较复杂，对于后期反相制备很不利。

现在还缺乏一种有效的制备多肽盐原料药的方法，因此仍然迫切需要开发新的多肽盐的纯化工艺。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于为了克服现有技术中鞣酸加压素的制备工艺复杂、收率低的缺陷，而提供了一种鞣酸加压素的制备方法。本发明的鞣酸加压素的制备方法以鞣酸加压素粗品为起始原料，经过高压反相色谱纯化和脱盐步骤，制备高纯度的鞣酸加压素的方法。

发明人经过反复的研究发现，目前高压反相色谱法经典纯化的填料是硅胶基质，其柱效好，分辨率高，但色谱条件pH2-7耐受较窄；而安捷伦聚合物填料PLRP-S为苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物，可耐受较宽阔的pH范围(pH范围可达1-14)，并且可用1M NaOH溶液再生，也可以精准控制孔径大小与孔径形态，使得溶质分子无障碍扩散，相对于硅胶基质，其增加了有效表面积，能保持很好的柱效和分辨率，且提升了填料的载样量。

本发明提供了一种鞣酸加压素的制备方法，其包括下述步骤：采用高效液相反相色谱法将加压素粗品溶液依次进行反相纯化、反相脱盐，即可；高效液相反相色谱法的填料为苯乙烯-二乙烯基苯(PS-DVB)共聚物。

所述的加压素粗品溶液较佳地为加压素粗品溶于体积百分比浓度为5％的乙腈水溶液形成的10g/L溶液。

其中，所述的反相纯化的条件优选如下：流动相A为体积百分比为0.1％的三氟乙酸水溶液，流动相B为体积百分比为0.1％的三氟乙酸乙腈溶液，流动相C为所述的加压素粗品溶液，流速为180～220mL/min(较佳地为200mL/min)，检测波长为220nm；

按照下表的条件进行在线上样、洗脱，百分比为体积百分比；