[发明专利]一种苯丙酮酸还原酶及其在不对称合成(R)‑苯乳酸中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种苯丙酮酸还原酶及其在不对称合成(R)-苯乳酸中的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

苯乳酸(Phenyllactic acid，PLA)，又名2-羟基-3苯基丙酸，是丹参素(β-3,4一二羟基苯基乳酸钠)的衍生物，与丹参素有相同的药理功能，可以调节人体内的类固醇的水平和抗血小板聚集的活性。苯乳酸也是合成许多药物的重要中间物，比如：降血糖药恩格列酮(Englitazone)、非蛋白氨基酸施德丁(Statine)、抗艾滋病毒制剂、新型驱肠虫药PFl022A、苯丙氨酸、治疗干燥皮肤的乳膏或制剂等。除此之外，苯乳酸是近年来新发现的新型的生物防腐剂，具有着广泛的抗菌谱，对革兰氏阳性菌(如：金黄色葡萄球菌，单核增生性李斯特菌)，革兰氏阴性菌(如：大肠杆菌，沙门氏菌)和真核微生物(如：曲霉青霉)等均有抑制作用。

苯乳酸的生物合成主要包括发酵法和生物转化法，Kamata M等人利用乳酸发酵短杆菌(Brevibacterium Lactofermentum)发酵制备(R)-PLA，产物浓度为1.94g/L；2000年，Lavermicoccca P等人发现植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)能用于不对称合成(R)-PLA，产物浓度为0.056g/L；2004年，李德茂等人采用菌株溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)T0l发酵制备(R)-PLA，产物浓度为1.59g/L；2011年，郑兆娟等人采用芽孢乳酸菌(Bacillus coagulans)菌株不对称还原苯丙酮酸制备苯乳酸，产物浓度为37.3g/L；2013年，郁书怀等人将菌株戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)应用于不对称合成苯乳酸，产物浓度为0.9g/L。2013年，郑兆娟等通过定点突变的方法对来源于保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)的羰基还原酶进行了分子改造，在1.5小时内可将50mM苯丙酮酸还原为苯乳酸，且ee>99％。

由以上数据可以看出采用发酵法制备苯乳酸的产率较低，提取困难，而生物转化法制备苯乳酸的底物上载量和产率均有所提高，但是仍不能达到工业化生产的要求，需要进一步开发高效苯丙酮酸还原酶。本发明提供了一种苯丙酮酸还原酶，可以高效不对称还原苯丙酮酸(及其钠盐)生成(R)-2-羟基-3苯基丙酸((R)-PLA)，该反应具有不需外源添加昂贵辅酶，反应条件条件温和，操作简单等优点。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种乳杆菌(Lactobacillus sp.)，该菌于2014年11月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9967，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

所述乳杆菌CGMCC No.9967所产的苯丙酮酸还原酶的催化活性高、对映选择性强、底物耐受性好。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种新的苯丙酮酸还原酶，能以苯丙酮酸或其盐为底物经不对称还原制备(R)-苯乳酸，所述苯丙酮酸还原酶是：(a)由SEQ ID No.2所示氨基酸组成的蛋白质；或(b)由SEQ ID No.2所示氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而得到的具有苯丙酮酸还原酶活性的衍生蛋白质。

在本发明的一种实施方式中，所述衍生蛋白质具有SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列。

在本发明的一种实施方式中，编码所述苯丙酮酸还原酶的基因具有SEQ ID No.1(LcKAR)所示的碱基序列；或对SEQ ID No.1所示碱基序列的一个或多个碱基进行替换、缺失或增加得到的编码具有苯丙酮酸还原酶活性的蛋白的碱基序列。由于密码子的简并性，编码所述苯丙酮酸还原酶的碱基序列并不局限于SEQ ID No.1，本领域技术人员可以通过适当引入替换、缺失、改变、插入或增加来获得该碱基序列的同系物，只要其表达的重组酶保持苯丙酮酸还原活性即可。

在本发明的一种实施方式中，编码所述苯丙酮酸还原酶的基因的碱基序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示。