[发明专利]一种桔青霉半连续发酵制备核酸酶P1的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种桔青霉半连续发酵生产核酸酶P1的方法。

背景技术

5’-核苷酸已广泛应用于食品、生化工业以及制药工业。在食品行业中，己经由最初的食品助鲜剂，扩展为具有提高生物体免疫功能的功能性食品添加剂，可以添加在面包、饼干等食品中，尤其在婴幼儿食品中的使用效果非常明显，能够有效增强婴幼儿抵抗细菌性痢疾的能力，减少腹泻的发生；在医药领域，5’-核苷酸不但能够作为药物使用，而且还是许多抗病毒抗肿瘤药物的生产原料；此外，核苷酸制剂还可以作为动植物生长调节剂，有着明显的增产、增重功效。

核苷酸生产主要采取三种方法：化学合成法、微生物发酵法及酶解法。酶解法由于降解RNA可以一次得到四种核苷酸的混合物，且酶反应收率较高，国内外工业化生产核苷酸均采用此法。在酶解法制备核苷酸中所需的酶是核酸酶Pl，它是一种能够水解RNA获得四种5’-核苷酸的磷酸二酯酶，其酶解产物杂质少后续分离工艺简单，国外一般采用该方法进行核苷酸的生产。

桔青霉属于不对称青霉组，绒状青霉亚组，桔青霉系，是核酸酶P1的重要生产菌种。国内外生产核酸酶P1主要通过桔青霉液体深层发酵，属于分批发酵，该方法耗时较长。如何高效的生产核酸酶P1，降低生产成本，已成为核苷酸生产的首要任务。

发明内容

本发明索要解决的技术问题是提供一种桔青霉半连续发酵生产核酸酶P1的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种桔青霉半连续发酵制备核酸酶P1的方法，使用包含了维生素B类物质的发酵培养基，进行桔青霉半连续发酵制备核酸酶P1。

其中，所述的桔青霉为CGMCC No.2014。该菌株记载在中国专利CN101067116A中。

其中，所述的维生素B类物质为泛酸、烟酸、生物素、叶酸、维生素B1、维生素B2、吡哆醇和氰钴胺中的任意一种或几种，优选泛酸、烟酸、生物素、叶酸、维生素B1和维生素B2中的任意一种或几种，最优选泛酸、烟酸和叶酸三者的组合；发酵培养基中维生素B类物质总浓度为0.001g/L～1g/L，优选0.05-0.8g/L，最优选0.1-0.8g/L

其中，所述的发酵培养基组分如下：葡萄糖0.5～50g/L，蛋白胨0.05～5g/L，磷酸二氢钾0.01～5g/L，磷酸氢二钾0.01～5g/L，硫酸镁0.01～5g/L，氯化钙0.01～5g/L，维生素B类物质0.001～1g/L，溶剂为水，pH5-8。

上述桔青霉半连续发酵制备核酸酶P1的方法，优选包括如下步骤：

a桔青霉在发酵罐中发酵一段时间，待核酸酶P1酶活增长至稳定后放出一定体积的发酵液，发酵罐中留存的发酵液作为下一批发酵种子；

b通过向发酵罐补加无菌发酵培养基继续发酵培养，待酶活增至稳定后再次放出一定体积的发酵液，发酵罐中留存的发酵液作为下一批发酵种子；

c重复步骤b直至桔青霉产酶能力下降至一定程度后停止发酵。

步骤a中，所述的发酵罐体积为20L～200T，优选1T～50T；所述的发酵一段时间，时间为10～100h，优选20～60h。

步骤a和b中，所述的酶活增长至稳定，是指酶活为3000～6500U/mL，优选4000～6000U/mL。

步骤a和b中，所述的放出一定体积的发酵液，是指放出发酵罐中发酵液体积的20％～95％的发酵液，优选60-90％。

步骤c中，重复步骤b的次数为2～20次，优选10～15次。

步骤c中，所述的桔青霉产酶能力下降至一定程度，是指核酸酶P1酶活小于3000U/mL。

本发明中，核酸酶P1酶活定义：将1.9ml的底物溶液(含有浓度为1％左右的RNA；0.2M pH5.2的醋酸缓冲液以0.0005M的ZnSO4)于70℃恒温水浴10min后，加入0.1ml经适当稀释的酶液，70℃保温15min后加入2.0ml核酸沉淀剂(0.25％钼酸铵-2.5过氯酸)，冰水浴20min后离心、取上清夜用蒸馏水稀释一定倍数，测定其260nm处的吸光值为A260。以先加沉淀剂者作为对照，其它操作同前。在上述条件下，每分钟所生成的核苷酸量在260nm处的吸光值的差值为1.0时定义为1个酶活力单位。