[发明专利]当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞及其制备和培养方法

权利要求书

1.当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

1）外植体的选取和灭菌：取当归属植物贮藏根作为外植体，清洗干净后，再进行灭菌处理，使外植体的表面和内部均无菌体存在；

2）外植体的切片：将上述灭菌后的外植体在无菌条件下进行切片，得外植体切片；

3）筛选培养：将切片贴附于筛选培养基上；于4℃~30℃条件下处理16~72h，使切片中非形成层部分的细胞不发生分裂；

所述筛选培养基为含有蔗糖1～6%和琼脂7.5~8.5g/L的MS培养基，该培养基pH为2～12；

4）分离培养：将上述筛选培养后的外植体切片取出放入切片液中进行恢复，然后再将切片放入分离培养基中进行培养，促进形成层细胞的分裂且不使其发生脱分化，而其他组织细胞死亡或是不分裂；培养6~16天后获得初步分离出来的形成层细胞；

所述分离培养基为含有生长素0.1～2mg/L、蔗糖1～6%、琼脂7.5~8.5g/L的MS培养基，该培养基pH为5.0～5.9；

所述生长素选自二氯苯氧乙酸（2，4-D）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）和吲哚乙酸（IBA）中至少一种；

5）继代培养：将上述分离出的形成层细胞移至继代培养基中培养5～16天，然后转移至分离培养基中培养5～16天，再转移至继代培养基进行重复交替地培养，交替培养后获得的大量细胞中仍然含有大量小液泡结构，这些细胞即为当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞； 

所述继代培养基为含蔗糖1～6%、0.2~1.2mg/L 2,4-D、0.01~0.5mg/L激动素KT、0.5~2mg/L NAA、7.5~8.5g/L琼脂、0.08~0.12g/L活性炭的B5培养基，该培养基pH为5.0～5.9。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中所述灭菌处理的具体过程为：先进行表面灭菌，即对洗净的外植体依次经乙醇溶液、次氯酸钠溶液、升汞溶液进行表面灭菌，清洗干净后；再进行深层灭菌，即将表面灭菌后的外植体在防褐化深层灭菌液中振摇20～40min。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述防褐化深层灭菌液为含有蔗糖1～6%、青霉素100~400mg/L、链霉素100~400mg/L、头孢霉素100~400mg/L、多菌灵0.5~2g/L、L-抗坏血酸100~400mg/L、柠檬酸100~400mg/L、0.008‰~0.020‰吐温-20的1/2MS培养基，该培养基pH为5.0～5.9。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）中所述外植体切片厚0.5～2mm，含有形成层。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3）中所述筛选培养基的pH为2～5或8~12。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4）中所述切片液为含有蔗糖1～6%、青霉素100~400mg/L、链霉素100~400mg/L、头孢霉素100~400mg/L、L-抗坏血酸100~400mg/L、柠檬酸100~400mg/L的1/2MS培养基，该培养基pH为5.0～5.9。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4）分离培养的培养条件和步骤5）中所述继代培养的培养条件均为：温度为24~26℃、湿度为50~70%。

8.根据权利要求1～7任一所述的方法，其特征在于：所述的当归属植物包括当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels、白芷Angelica dahurica （Fisch. ex Hoffm.）Benth. et Hook. f. ex Franch. et Sav、紫花前胡Angelica decursiva (Miq.) Franch. et Savat、疏叶当归Angelica laxifoliata Diels、拐芹Angelica polymorpha Maxim、重齿当归Angelica biserrata (Shan et Yuan) Yuan et Shan。