[发明专利]当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞及其制备和培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞及其制备和培养方法。

背景技术

目前植物生物技术都以诱导愈伤组织、培养植物器官或是分离原生质体等方法进行研究，而形成层的分离培养方法近期才出现。

愈伤组织为植物脱分化后形成的薄壁组织，但是经过脱分化后，其次级代谢产物的量与种类都会减少，同时含有中央大液泡，在扩大培养（如发酵罐培养等）时中央大液泡容易碎裂导致细胞死亡，培养环境苛刻。

植物的器官培养一般包括植物根或是芽的培养，保持了植物的体细胞的一些状态，相对于愈伤组织而言，次级代谢产物的含量较多，但由于其易分化成为植物个体，导致其不能较好的用于工业生产。

植物的原生质体不含有细胞壁，细胞较为脆弱，对渗透压，pH等要求特别严格，一般用于转基因介导，再用于植株再生，很难用于工业生产中。

由于形成层分生组织拥有无限增殖的特征，因而被称为“植物干细胞”。形成层细胞系的分离和扩大培养在近期才出现，2010年11月，Nature Biotechnology中刊登了一篇名为《Cultured cambial meristematic cells as a source of plant natural products》的文章，成功的分离扩大了红豆杉的形成层干细胞系。这种未脱分化细胞的细胞活性以及次级代谢产物含量较愈伤组织多100倍以上，同时发现其具有大量小液泡结构，在工业生产中具有更大的优势。

在含有贮藏根的植物中，贮藏根的作用为吸收无机盐贮存养分，含有大量的淀粉以及较多的次级代谢产物，而植物根的形成层是通过细胞横向分裂并分化成为根的髓部以及韧皮部，因此贮藏根的形成层是这些植物根部增粗的主要组织。但是在生长过程中贮藏根中含有大量的内生菌与共生菌。所以在作为外植体培养组织时需要进行深度灭菌来减少组织培养过程中的污染。

国际专利WO2010/137878 KO以及中国专利CN102459572A公开了银杏科的形成层来源的植物干细胞及其分离方法提供了木本植物的形成层干细胞系的分离扩大的方法。

国际专利WO2009/038416 EN 以及中国专利CN101939415A公开了来自静止中心的植物干细胞系及其分离方法。

国际专利 WO2009/038417 EN以及中国专利CN101939414A公开了将来自具有储藏根的草本植物形成层的植物干细胞系及其分离方法，将人参、胡萝卜等一些贮藏根植物的干细胞进行分离扩大。该方法将含有贮藏根植物的根进行切片，通过渗透压处理，使切片中非形成层部分死亡或是不分裂，再通过适合的培养基将形成层干细胞系分离并扩大。

目前检测其细胞是否为干细胞的方法有通过显微镜检查是否为含有大量小液泡状态以及对辐射或是类辐射药物的敏感性来确定是否为植物干细胞系。

现有技术的缺点存在以下方面，通过实际运用，模仿关于贮藏根形成层细胞分离方法的专利的实验，发现在一些当归属植物中如当归（Angelica sinensis (Oliv.) Diels），白芷（Angelica dahurica （Fisch. ex Hoffm.）Benth. et Hook. f. ex Franch. et Sav），紫花前胡（Angelica decursiva (Miq.) Franch. et Savat）等植物中不能够分离出形成层干细胞系。说明现有贮藏根形成层细胞分离技术方法在如上植物中不适用，需要新的方法来处理这类植物，以分离出形成层干细胞系。

发明内容

本发明的目的在于提供一种当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞的制备方法。

本发明的另一目的在于提供一种当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞的培养方法。

本发明所采取的技术方案是：

当归属植物贮藏根形成层的植物干细胞的制备方法，包括以下步骤：

1）外植体的选取和灭菌：取当归属植物贮藏根作为外植体，清洗干净后，再进行灭菌处理，使外植体的表面和内部均无菌体存在；

2）外植体的切片：将上述灭菌后的外植体在无菌条件下进行切片，得外植体切片；

3）筛选培养：将切片贴附于筛选培养基上；于4℃~30℃条件下处理16~72h，使切片中非形成层部分的细胞不发生分裂； 

所述筛选培养基为含有蔗糖1～6%和琼脂7.5~8.5g/L的MS培养基，该培养基pH为2～12；