[发明专利]嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白、其制备方法及应用、其基因工程菌的构建

权利要求书

1.一种嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方法，其 特征在于，所述的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述构建方法包括以下步骤：

步骤A：高温烷烃地芽孢杆菌的培养

配置厌氧培养基，按照100体积份的厌氧培养基注入1体积高温烷烃地 芽孢杆菌的比例，将高温烷烃地芽孢杆菌接种到厌氧培养基中进行培养；

步骤B：基因组DNA的提取

将步骤A培养的高温烷烃地芽孢杆菌用细菌基因组DNA提取试剂盒提 取高温烷烃地芽孢杆菌的基因组，得到基因组DNA溶液；

步骤C：设计引物及用聚合酶链式反应法钓取嗜热β-1，4木聚糖酶-His 融合蛋白目的基因

通过在下游引物中终止密码子前加入6个His标签，在聚合酶链式反应过 程中同步获得融合蛋白xyl-his，其中，

上游引物：5’CCAGTCCCATGGATGCGGAACGTCGTGCGTAA3’， 划线部分为NcoI的酶切位点；

下游引物：5’ CGACGACTCGAGCTAATGATGATGATGATGATGTTTGTGGTCGATAATA GCCCA3’，划线部分为XhoI的酶切位点；

以步骤B所得基因组DNA溶液为模板，在所述上游引物和下游引物的 参与下进行聚合酶链式反应，得到聚合酶链式反应扩增产物，再对扩增产物进 行纯化，得到纯化的聚合酶链式反应产物，然后用限制性内切酶NcoI和Xho I进行双酶切，得到嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白目的基因；将其与同 样进行双酶切的pET-28a(+)质粒采用DNA连接酶进行连接，采用点击的方式 转化入大肠杆菌DH5α中，筛选5个克隆子提取质粒进行克隆片段测序鉴定， 成功获得含有融合蛋白的质粒pET-28a(+)-xyl-His；

步骤D：构建重组表达载体

将pET-28a(+)-xyl-His和pRSII418采用限制性内切酶NcoI和XhoI进行 双酶切，将获得的xyl-His片段与线性化的pRSII418质粒进行连接，得到重组 表达载体pRSII418-xyl-His；

步骤E：将重组表达载体转化到宿主细胞中

将步骤D所得重组表达载体转化到毕赤酵母中进行培养，采用腺嘌呤缺 陷型培养基进行筛选，并对筛选出的克隆子中质粒进行测序验证，最终获得了 具有嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因的腺嘌呤缺陷型毕赤酵母工程菌。

2.根据权利要求1所述的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌 的构建方法，其特征在于，按照德国微生物菌种保藏中心的配方配置步骤A 中的厌氧培养基。

3.根据权利要求1所述的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌 的构建方法，其特征在于，所述的聚合酶链式反应的反应体系按以下方法配制： DNA聚合酶1μl，DNA聚合酶缓冲液5μl，作为模板的基因组DNA溶液2μl， 2.5mM脱氧核苷酸混合物8μl，上游引物和下游引物各加40pmol，加超纯水 至总体积50μl。

4.根据权利要求1所述的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌 的构建方法，其特征在于，所述的聚合酶链式反应的反应程序包括以下两个步 骤：

步骤一、94℃预变性3min；

步骤二、然后98℃变性30s，退火温度从70-56℃，每个循环降低1℃， 退火时间30s，72℃延伸60s，共15个循环；之后再98℃变性30s，退火温度 55℃，退火时间30s，72℃延伸60s，共20个循环；最后再72℃延伸20min。

5.根据权利要求1所述的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌 的构建方法，其特征在于，所述步骤C所述的用限制性内切酶NcoI和XhoI 进行双酶切的酶切体系包括：500ng纯化的质粒，上游引物和下游引物各2μl， 限制性内切酶缓冲液4.9μl。