[发明专利]嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白、其制备方法及应用、其基因工程菌的构建

说明书

技术领域

本发明涉及一种嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌的构建方 法、所制备的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

木聚糖是植物细胞壁半纤维素的重要组成部分，它是仅次于纤维素、自然 界中含量第二丰富的多聚糖，几乎占地球可再生碳源的三分之一(Collins et.al.FEMSMicrobiologyReviews.2005，29：3-23)。木聚糖来源广泛，可由林 业、农业、木材加工以及造纸等工业的副产品获得，其主链主要是由木聚糖残 基以β-1，4-糖苷键构成。而根据来源的不同，木聚糖的侧链可以被阿拉伯 糖、葡聚糖醛酸、乙酰基等残基取代，由于成份复杂，木聚糖需要在包括木聚 糖酶、D-木糖苷酶、葡萄糖醛酸酶以及α-L-阿拉伯呋喃糖酶等的共同作用 下才能够被彻底降解。

β-1，4木聚糖酶(Endo-β-1，4-xylanase，EC3.2.1.8)主要从主链内部作 用于木糖苷键，能够专一降解木聚糖为低聚木糖和木糖，是木聚糖降解过程中 最重要的酶之一(KulkamiN，ShendyeA，RaoM.Molecularandbiotechnological aspectsofxylanases[J].FEMSMicrobiol.Rev.1999，23(4)：411-456)。能够产生 木聚糖酶的微生物有很多，包括丝状真菌、细菌、放线菌等。但较真菌所产木 聚糖酶而言，细菌木聚糖酶有更好的热稳定性，具有更广泛的工业应用前景， 并受到学术界的普遍关注(BadalC.Hemicellulosebioconversion[J].JInd MicrobiolBiotechnol，2003，30：279-291)。

木聚糖酶产生菌株高温烷烃地芽孢杆菌(Geobacillusthermoleovorans DSM5366)在75℃的高温下达到最佳生长环境，具有良好的耐热和耐酸性，非 常适合在生物质利用以及木糖、木糖醇等功能糖领域。通过序列比对发现，它 与其它已研究的木聚糖酶基因序列具有较低的同源性，我们希望通过此研究来 发掘性质优良的新型木聚糖酶源。

发明内容

本发明的目的是提供一种嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基因工程菌 的构建方法，以克服现有木聚糖酶源所产木聚糖酶与已研究的木聚糖酶基因序 列同源性低的缺陷；

本发明的另一目的是提供一种嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白；

本发明的另一目的是提供一种嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白的制备 方法；

本发明的另一目的是提供一种嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白的应用。

本发明是通过以下技术方案来实现的：一种嗜热β-1，4木聚糖酶-His融 合蛋白基因工程菌的构建方法，所述的嗜热β-1，4木聚糖酶-His融合蛋白基 因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，所述构建方法包括以下步骤：

步骤A：高温烷烃地芽孢杆菌的培养

配置厌氧培养基，按照100体积份的厌氧培养基注入1体积高温烷烃地 芽孢杆菌的比例，将高温烷烃地芽孢杆菌接种到厌氧培养基中进行培养；

步骤B：基因组DNA的提取

将步骤A培养的高温烷烃地芽孢杆菌用细菌基因组DNA提取试剂盒提 取高温烷烃地芽孢杆菌的基因组，得到基因组DNA溶液；

步骤C：设计引物及用聚合酶链式反应法钓取嗜热β-1，4木聚糖酶-His 融合蛋白目的基因

通过在下游引物中终止密码子前加入6个His标签，在聚合酶链式反应过 程中同步获得融合蛋白xyl-his，其中，

上游引物：5’CCAGTCCCATGGATGCGGAACGTCGTGCGTAA3’， 划线部分为NcoI的酶切位点；

下游引物：5’ CGACGACTCGAGCTAATGATGATGATGATGATGTTTGTGGTCGATAATA GCCCA3’，划线部分为XhoI的酶切位点；