[发明专利]连续法发酵生产L-乳酸的方法

说明书

技术领域

   本发明为生物发酵领域，特别涉及利用微生物发酵生产L-乳酸的方法。

背景技术

L-乳酸是一种重要的有机酸，在食品行业、材料行业有广泛的应用。其作为一种绿色化学品，可以合成聚乳酸、乳酸乙酯等可降解材料，因而在材料领域备受关注。目前，L-乳酸一般采用生物法合成，生产的菌种多为根霉属微生物，如少根根霉Rhizopus arrizhus、米根霉Rhizopus oryzae等。其中，米根霉作为美国FDA认证的安全生产菌株，具有生长迅速、环境适应能力强、分泌有机酸及蛋白质能力强等优势，为有机酸的优秀生产菌种。

传统米根霉生产 L-乳酸的技术中，几乎都采用分阶段的策略，如将乳酸的生产分为菌体生长和酸生产阶段，并以此设计开发了相应的工艺，即：通过提供不同的培养基或者培养策略来适应该分阶段培养技术需求。比如，在菌体生长阶段，提供相应的培养基以供孢子的萌发以及菌体最初的需要，该培养基中富含菌体生长的营养，如蛋白胨、酵母膏、以及含氮的各种粉浆；在生长阶段结束以后，富含营养成分的培养基与具有转化能力的菌体被转运至用于生产的培养基中，经过新环境的生长适应期，菌体生长并进行乳酸的生产，直至发酵结束。其中，分阶段发酵策略最明显的特征即进行的移种操作，移种量通常为发酵液体积的5-15%，通常的生长适应期也从12-24小时不等。该发酵策略带来的技术问题在于，环境的改变会带来迟滞期，迟滞期通常认为是对发酵不利的，如延长发酵的周期，部分菌体由于对环境的改变而失去代谢或者催化能力。为了解决迟滞的问题，现有技术也采取了各种工艺调整，如增加移种的量，虽然可以解决部分问题，但是也带来不利的效果，比如移种量的加大会导致产量下降以及糖酸转化率的降低。

米根霉产L-乳酸的产率、转化率、以及生产强度都可以进一步提高。

发明内容

发明人发现，在较高的葡萄糖浓度下，满足微生物的生长要求，残糖可快速的转化为乳酸。因此，为了解决现有技术中的问题，本发明提供了一种连续法发酵生产L-乳酸的方法。

本发明的技术方案为：连续法发酵生产L-乳酸的方法，其采用（1）经过活化原始菌株，在（2）固体培养原始菌株获得菌株孢子（3）将所述孢子与发酵罐中的原始培养基接触（4）培养菌株并产生含乳酸的培养基（5）分离纯化获得乳酸，其中，步骤（3）至步骤（4）在同一发酵罐中进行。

本发明优选的一种技术方案为：（1）活化原始菌株（2）采用固体培养原始菌株获得菌株孢子（3）将所述孢子与发酵罐中的原始培养基接触培养至（4）菌体生长阶段结束，其中在菌体生长阶段结束以后，通过固液分离，（5）分离部分培养基，（6）继续培养菌株并产生含乳酸的培养基并（7）分离纯化获得乳酸；从而使得在同一发酵罐中进行的发酵过程进一步提高产率、转化率、以及生产强度。

本发明优选的另一中技术方案为：（1）活化原始菌株（2）采用固体培养原始菌株获得菌株孢子（3）将所述孢子与发酵罐中的原始培养基接触培养至（4）菌体生长阶段结束，其中在菌体生长阶段结束以后，通过固液分离，（5）分离部分培养基，在分离后的培养基中，流加入糖含量高于原培养基的糖溶液（6）继续培养菌株并产生含乳酸的培养基并（7）分离纯化获得乳酸；

固液分离所得的培养基，在一个优选的方案中，将该培养基用于下一批次发酵培养基的配置；在另一优选的方案中，将该培养基用于该批次发酵培养基流加糖液的配置。经过该优选方案，实现了培养基的全利用。

本发明的技术方案中，菌株的活化采用平板进行培养，活化后的菌株接入固体培养基，其中采用PDA培养基进行孢子培养，于25-30℃培养5-14天，至平板表面布满气生菌丝并变为褐色或者黑褐色。用无菌生理盐水冲洗获得菌株孢子液，放置于放有无菌玻璃珠的三角瓶中，调节孢子浓度为1-9×10⁹个/mL，4℃保存待用。

在发酵培养时，培养基中含有碳源、氮源与其他营养源。选择的氮源为培养中常见的氮源，包括尿素、硝酸铵、碳酸铵、玉米浆、蛋白胨、牛肉膏等，其含量根据氮源选择的不同，最适含量在0.5-4 g/L之间，如，优选2 g/L的尿素，或者1 g/L的蛋白胨，或者2 g/L的牛肉膏/L作为氮源进行培养发酵。其他营养源，如磷酸盐，无机盐等营养因子的加入可在不同程度上改变乳酸的产量。