[发明专利]副溶血性弧菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒

权利要求书

1.一种应用环介导等温扩增检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的检测引物组，其特征在于，由下列引物组成：

上游外引物为F3：5’-GCAAAGAAACGCTTGGCG-3’；

下游外引物B3：5’-TGCATAGCAATGTTGTCGCT-3’；

上游内引物FIP：5’-TCTCTCGGGTGGTGGATGGGTTTCGTTACACTCCGTTCGC-3’；

下游内引物BIP：5’-ATGGTTTGCTACTCTCGCACCCTCGGCTGACAAATGGCTCTA-3’。

2.一种非疾病的诊断和治疗目的的副溶血性弧菌的检测方法，其特征在于，对样品进行增菌培养获得增菌液，提取增菌液中的细菌DNA，然后通过环介导等温扩增的方法用权利要求1所述的检测引物组对细菌DNA进行选择性扩增，确认是否存在有扩增产物。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的样品为水产品。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的对样品进行增菌培养是将样品接入质量百分数3％Nacl碱性蛋白胨水，36℃±1℃培养10h，获得增菌液。

5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的通过环介导等温扩增的方法用权利要求1所述的检测引物组对细菌DNA进行选择性扩增具体为：环介导等温扩增体系为体系总体积25μL，包括2.5μL 10×Thermopol反应缓冲液、0.4μL 10mmol/LdNTPs、0.5μL10μmol/L上游外引物F3、0.5μL 10μmol/L下游外引物B3、1μL 40μmol/L上游内引物FIP、1μL 40μmol/L下游内引物BIP、0.6μL100mmol/L MgSO₄、12.5μL 2mol/L甜菜碱、2μL灭菌双蒸水ddH₂O，1μL 8U/μL Bst DNA聚合酶和3μL细菌DNA模板，反应条件为在温度为60～65℃孵育45～60min。

6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述的确认是否存在有扩增产物选用荧光显色检测，具体是在80℃终止反应1～2min，在扩增反应管中加入SYBR GreenⅠ显色剂，1～5min后观察结果，如果颜色为橙色，则样品副溶血性弧菌阴性，无副溶血性弧菌，如果颜色为绿色，则样品副溶血性弧菌阳性，含有副溶血性弧菌。

7.一种副溶血性弧菌的检测试剂盒，包括环介导等温扩增试剂和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组由下列引物组成：

上游外引物为F3：5’-GCAAAGAAACGCTTGGCG-3’；

下游外引物B3：5’-TGCATAGCAATGTTGTCGCT-3’；

上游内引物FIP：5’-TCTCTCGGGTGGTGGATGGGTTTCGTTACACTCCGTTCGC-3’；

下游内引物BIP：5’-ATGGTTTGCTACTCTCGCACCCTCGGCTGACAAATGGCTCTA-3’。