[发明专利]副溶血性弧菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种副溶血性弧菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒。

背景技术：

副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)在世界范围内被公认是一种重要的食源性致病菌，亦是近年来我国微生物性食物中毒的头号致病菌。副溶血性弧菌食物中毒可引起急性胃肠炎，少数情况还能引发败血病，危及生命。水产品中较高的副溶血性弧菌污染率导致了由该菌引起的食物中毒案例在世界各地时有发生。仅2006年夏天，智利某地就报导了900多例VP相关的腹泻病例；2007年8月25日～9月25日，我国厦门市连续发生两起VP食物中毒，中毒2000余人。

目前，美国和欧盟对进口水产品都强制性要求进行副溶血性弧菌的检测，检验结果为阴性方可通关，否则出口的水产品将被“全部自动扣留”就地销毁。这给我国水产品的出口设置了技术壁垒。国际微生物标准委员会和日本、英国、加拿大等国及我国香港地区都提出对水产品开展副溶血性弧菌的检测工作。我国也要求将副溶血性弧菌的检测作为水产品质量的检测标准(GB 4789.7-2013，SNT 2142-2008，SN0173-1992，GB18406.4-2001)。目前，我国对副溶血性弧菌的检测主要是根据GB 4789.7-2013，这需要5～7d时间，难以适应快速准确的要求。随着现代科学技术的不断发展，特别是免疫学、生物化学、分子生物学的不断发展，人们已创建了不少快速、简便、特异、敏感且适用的副溶血性弧菌检测方法。

尽管已有针对副溶血性弧菌tlh基因和一些其他序列建立LAMP方法的专利报道(专利申请号：2007100304416)，但由于tlh等基因不够特异(Croci et al.,2007)，以此建立的LAMP方法在实际应用中具有一定的局限性。

发明内容：

本发明的第一目的是提供一种快速、特异好、灵敏高的应用环介导等温扩增检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的检测引物组，利用该检测引物组可以特异性的检测副溶血性弧菌。

本发明在选择新的特异靶基因irgB的基础上(Yu et al.,2010)，通过筛选和优化引物，建立了一种LAMP扩增方法，通过摸索样品前处理条件(增菌)，将样品处理技术结合LAMP技术有机结合，建立用于水产品中副溶血性弧菌的快速检测方法。该方法的应用对于水产品快速检测和保障水产品质量安全具有重要意义，从而实现了本发明的目的。

本发明的应用环介导等温扩增检测副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的检测引物组，其特征在于，由下列引物组成：

上游外引物为F3：5’-GCAAAGAAACGCTTGGCG-3’(如SEQ ID NO.1所示)；

下游外引物B3：5’-TGCATAGCAATGTTGTCGCT-3’(如SEQ ID NO.2所示)；

上游内引物FIP：5’-TCTCTCGGGTGGTGGATGGGTTTCGTTACACTCCGTTCGC-3’(如SEQ ID NO.3所示)；

下游内引物BIP：5’-ATGGTTTGCTACTCTCGCACCCTCGGCTGACAAATGGCTCTA-3’(如SEQ ID NO.4所示)。

本发明的第二个目的是提供一种非疾病的诊断和治疗目的的副溶血性弧菌的检测方法，其特征在于，对样品进行增菌培养获得增菌液，提取增菌液中的细菌DNA，然后通过环介导等温扩增的方法用上述检测引物组对细菌DNA进行选择性扩增，确认是否存在有扩增产物。

所述的样品可以是各种可能含有副溶血性弧菌的样品，如水产品。

所述的对样品进行增菌培养优选是将样品接入质量分数3％Nacl碱性蛋白胨水，36℃±1℃培养10h，获得增菌液。