[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒IgG抗体检测试剂盒

权利要求书

1.一种猪流行性腹泻病毒IgG抗体检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒内设有包被猪流行性腹泻病毒抗原的96孔免疫检测反应板5块、120mL10倍浓缩洗涤液1瓶、120mL样品稀释液1瓶、50μL阳性血清1管、50μL阴性血清1管、20μL辣根过氧化物标记的SPA酶标抗体1管、60mL底物显色液A液1瓶、1.5mL每管的底物显色液B液2管。

2.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒IgG抗体检测试剂盒，其特征在于：所述包被猪流行性腹泻病毒抗原96孔免疫检测反应板的制备方法如下：

（1）、将培养瓶中单层猴肾细胞的培养基倒掉，然后向培养瓶中加入PBS洗涤液，每cm²单层猴肾细胞对应的PBS洗涤液为0.027mL，之后摇动培养瓶，使洗涤液覆盖单层猴肾细胞面，以除去培养瓶中残留的培养基，倒掉PBS洗涤液后备用；

（2）、向步骤（1）处理过的培养瓶中加入质量浓度为0.25%的胰酶-EDTA-Na₂溶液，每cm²单层猴肾细胞对应的胰酶-EDTA-Na₂溶液为0.013mL，摇动培养瓶，直至胰酶-EDTA-Na₂溶液覆盖单层猴肾细胞，室温下静置2min后，倒掉瓶中的胰酶-EDTA-Na₂溶液，在室温下静置5min，振动培养瓶直至单层猴肾细胞全部脱落，备用；

（3）、向步骤（2）处理过的培养瓶中加入MEM培养基，且MEM培养基中胎牛血清的质量浓度为5%，用移液枪吹散猴肾细胞，直至猴肾细胞呈单个分布，即制得细胞悬液，备用；

（4）、将细胞悬液与胎牛血清质量浓度为5%的MEM培养基按1:5的体积比混合并搅拌均匀，制得培养液，

（5）、用排枪吸取步骤（4）制备的培养液，并以每孔120μL加入到96孔免疫检测反应板中，振动免疫检测反应板，使培养液在孔内均匀分布，之后将免疫检测反应板放入温度为37℃、CO₂体积浓度为5%的培养箱中培养24h，倒掉免疫检测反应板中的培养液，并用PBS洗涤溶液清洗1-2次，备用；

（6）向步骤（5）处理过的96孔免疫检测反应板中加入无血清培养基稀释过的猪流行性腹泻病毒，使每孔病毒感染复数为5TCID₅₀，之后向免疫检测反应板中加入浓度为3μg/mL的胰蛋白酶，混匀后放入温度为37℃、CO₂体积浓度为5%的培养箱中培养48h，将96孔免疫检测反应板的液体倒掉，并用PBS洗涤溶液清洗3次，在温度为30℃的真空干燥仪内干燥，直至孔边缘处出现白色圈；

（7）、向步骤（6）处理过的96孔免疫检测反应板中加入固定液，静置30min后弃去固定液，放入温度为30℃的真空干燥仪内干燥，直至孔边缘出现白色圈，所述固定液是将丙酮与PBS洗涤溶液按33:67的体积比混合并搅拌均匀后制得；

（8）、将步骤（7）制得的96孔免疫检测反应板抽真空后置于温度为-20℃下保存，即制得包被猪流行性腹泻病毒抗原的96孔免疫检测反应板。

3.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒IgG抗体检测试剂盒，其特征在于：每升10倍浓缩洗涤液的制备方法是将80g的NaCl、2g的KCl、14.2g的Na₂HPO₄、2.7g的KH₂PO₄溶入到900mL去离子水中，并定容至1000mL，在温度为120℃下灭菌30分钟后，转入温度为4℃下密闭保存即可。

4.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒IgG抗体检测试剂盒，其特征在于：所述底物显色液A液的制备方法是将去离子无菌水、体积百分比浓度为30%的双氧水和pH为5.0、摩尔浓度为0.1moL/L的乙酸盐缓冲液按5:0.026:5的体积比混合并搅拌均匀后制得。

5.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒IgG抗体检测试剂盒，其特征在于：所述底物显色液B液的制备方法是在每毫升二甲基甲酰胺中加入4mg3-氨基-9-乙基咔唑，混合并搅拌均匀后即可。

6.根据权利要求1所述的一种猪流行性腹泻病毒IgG抗体检测试剂盒，其特征在于：所述底物显色液的制备方法是将底物显色液A液和底物显色液B液按照20:1的体积比混合并搅拌均匀后制得。