[发明专利]一种猪流行性腹泻病毒IgG抗体检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种猪流行性腹泻病毒IgG抗体检测试剂盒。

背景技术

猪流行性腹泻病毒病是危害我国养猪业的主要流行型传染病之一，是猪的一种具有高度接触性的烈性传染病，具有发病急和死亡率高等特点。目前我国流行的新毒株对不同品种和年龄的猪都具有感染新，初生仔猪1周龄内感染率高达100％，死亡率达50％~100％。以前的老毒株仅造成地方性流行，自2011年以来，我国开始检测到该病毒的新变异株，造成巨大损失。有报道表明，美国自2013年3月至2014年5月之间，由该新流行病毒株感染造成500万头出生仔猪死亡，损失令人震惊。该病在我国大规模流行3年多，所造成的经济损失目前还没有具体的数据。从临床一线的反应来看，新的流行性腹泻病毒毒株对养猪业所产生的负面影响将还会持续发酵。因此，在开发有效疫苗的同时，配备疫苗效果评价及临床抗体检测的手段与方法显得十分必要。

对于新的流行性腹泻病毒毒株特异性抗体的检测方法主要有中和试验，酶联免疫吸附法（ELISA），胶体金法等方法。其中中和试验，需要活的病毒、细胞，材料来源不及时、需要的技术和设备条件较高、难以高通量检测，操作人为因素影响大，而仅限于个别实验室内部使用，无法批量工业化生产，更不可能在基层养殖场的一线检测之用。胶体金便于临床定性分析抗体阳性与阴性问题，而无法做到精确定量。ELISA是一项国内外通用的，目前在各个检测领域技术最为成熟的一种方法，商品化的试剂盒也非常好用。然而，目前国内的技术力量没有达到相应的国际水平，迟迟没有中国自己的猪流行性腹泻病毒ELISA抗体检测试剂盒上市。而进口猪流行性腹泻病毒ELISA抗体检测试剂盒价格昂贵，临床应用成本高，大大增加了养殖户的负担。

鉴于上述情况，开发一种能够适合工业化批量生产、质量可控、性能稳定、高通量、成本低廉、特异性和敏感性好的猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒十分必要，特别重要的是，该试剂盒的成本不能太高，否则，难以推广应用。基于以上种种背景，建立了本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种猪流行性腹泻病毒IgG抗体检测试剂盒，能够快速、准确的进行检测。

本发明为解决上述问题所采取的技术方案是：一种猪流行性腹泻病毒IgG抗体检测试剂盒，该试剂盒内设有包被猪流行性腹泻病毒抗原的96孔免疫检测反应板5块、120mL10倍浓缩洗涤液1瓶、120mL样品稀释液1瓶、50μL阳性血清1管、50μL阴性血清1管、20μL辣根过氧化物标记的SPA酶标抗体1管、60mL底物显色液A液1瓶、1.5mL每管的底物显色液B液2管。

所述包被猪流行性腹泻病毒抗原96孔免疫检测反应板的制备方法如下：

（1）、将培养瓶中单层猴肾细胞的培养基倒掉，然后向培养瓶中加入PBS洗涤液，每cm²单层猴肾细胞对应的PBS洗涤液为0.027mL，之后摇动培养瓶，使洗涤液覆盖单层猴肾细胞面，以除去培养瓶中残留的培养基，倒掉PBS洗涤液后备用；

（2）、向步骤（1）处理过的培养瓶中加入质量浓度为0.25%的胰酶-EDTA-Na₂溶液，每cm²单层猴肾细胞对应的胰酶-EDTA-Na₂溶液为0.013mL，摇动培养瓶，直至胰酶-EDTA-Na₂溶液覆盖单层猴肾细胞，室温下静置2min后，倒掉瓶中的胰酶-EDTA-Na₂溶液，在室温下静置5min，振动培养瓶直至单层猴肾细胞全部脱落，备用；

（3）、向步骤（2）处理过的培养瓶中加入MEM培养基，且MEM培养基中胎牛血清的质量浓度为5%，用移液枪吹散猴肾细胞，直至猴肾细胞呈单个分布，即制得细胞悬液，备用；

（4）、将细胞悬液与胎牛血清质量浓度为5%的MEM培养基按1:5的体积比混合并搅拌均匀，制得培养液，

（5）、用排枪吸取步骤（4）制备的培养液，并以每孔120μL加入到96孔免疫检测反应板中，振动免疫检测反应板，使培养液在孔内均匀分布，之后将免疫检测反应板放入温度为37℃、CO₂体积浓度为5%的培养箱中培养24h，倒掉免疫检测反应板中的培养液，并用PBS洗涤溶液清洗1-2次，备用；