[发明专利]Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法

权利要求书

1.一种Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法，其特征在于经过下列各步骤：

（1）Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒的接种培养：按1mL病毒液/瓶的量，将浓度均为4.0MOI/mL的Ⅱ型登革病毒液、Ⅲ型登革病毒液分别接种到生长致密、透明度好的白纹伊蚊C6/36细胞上，于温度为28+2℃、CO₂体积浓度为5%的环境中，恒温吸附1小时，于相同环境中，补加病毒液9倍体积的下列病毒维持液：RPMI-1640培养基 + 2%(w/v)小牛血清 + 0.12%(w/v)的碳酸氢钠溶液，培养至第5天，随后于相同环境中，补加碳酸氢钠溶液直至碳酸氢钠含量为0.12%(w/v)，培养至第8～9天，当白纹伊蚊C6/36细胞病变效应达++++时，收集细胞液，于4℃、3500×g离心分离5min，收获上清液，分别得Ⅱ型、Ⅲ型病毒液；

（2）构建Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒标准品质粒：

a．根据NCBI数据库中Ⅱ型和Ⅲ型登革病毒标准株序列（GenBank: M29095.1；NC_001475），按下述设计特异性引物：

Ⅱ型登革病毒前膜蛋白区域的PCR正、反向引物：

DENV-2For：5'-AAAAAGGCGAGAAATACGCC-3'

DENV-2Rev：5'-CACACAATTCACCAAGGTCCA-3'

Ⅲ型登革病毒前膜蛋白区域的PCR正、反向引物：

DENV-3For：5'-ACAGTTTCGACTCGG-3'

DENV-3Rev：5'-CTTTCATTCTTCCCC-3'；

b．按常规方法分别提取步骤（1）所得Ⅱ型、Ⅲ型病毒液中的登革病毒基因组RNA，再用1U/μl的DNase于42℃下分别处理Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒基因组RNA 3min，以消化残留的DNA，收获的Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒基因组RNA通过RT-PCR的方法，利用步骤a的特异性引物分别扩增Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒前膜蛋白区域，分别得到对应的扩增产物，再将扩增产物分别连接到pMD-18T simple克隆载体上，转化DH5α感受态细胞，挑单克隆进行测序鉴定，分别获得Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒前膜蛋白区目的基因序列鉴定正确的阳性菌株；

c．将步骤b所得序列鉴定正确的阳性菌株分别进行常规培养，分别获得Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒标准品质粒，并用紫外分光光度计分别测定Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒标准品质粒的浓度，再按下列公式计算标准品质粒的拷贝数：

Number of copies（copies/μl） = (Amount×6.022×10²³)/（Length×1×10⁹×650）

其中，Amount为紫外分光光度计测得标准品质粒所测含量（ng/μl），Length代表模板DNA长度；

（3）参照步骤（2）b所得Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒前膜蛋白区目的基因序列设计下列Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒荧光定量PCR特异性引物：

D2F：5'-GCAGGGATACTGAAGAGATGGG-3'

D2R：5'-TGGTTCTCCGTTACGTGTGG-3'

D3F：5'-TGGATCACAGTTGGCGAAGA-3'

D3R：5'- CCCCCGACTTCTTGAAGGTT-3'；

（4）利用步骤（2）c所得Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒标准品质粒分别检测病毒培养上清样品或患者血清样品的Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒拷贝数，具体检测方法如下：

a．将步骤（2）c所得Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒标准品质粒分别用双蒸水按梯度稀释至10^-9，按PCR反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测标准品质粒扩增效率和特异性，通过荧光定量PCR检测直接获得Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒标准品质粒的扩增曲线与溶解曲线，同时根据荧光定量PCR检测所得标准品Ct值作为X轴，标准品拷贝数log₁₀作为Y轴分别绘制Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒标准品质粒的标准曲线，进而得到Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒标准品质粒的标准曲线方程：

所述PCR反应体系如下：

表1 荧光定量PCR反应体系（反应总体积为20μl）

采用的反应程序如下：

b．将待测的病毒培养上清样品或患者血清样品，根据需要分别用PBS缓冲液按梯度稀释至10^-5，得到病毒培养上清样品或患者血清样品的梯度稀释液；

c．按常规方法提取步骤b所得梯度稀释液中的登革病毒基因组RNA，再用1U/μl的DNase于42℃处理病毒基因组RNA 3min以消化残留的DNA，按下列表2中的条件将病毒RNA逆转录成cDNA：

表2  逆转录反应体系：10μl

逆转录反应程序采用：37℃下35min，随后4℃下10min；

d．按步骤（4）a提供的PCR反应体系以SYBR法实时荧光定量PCR检测步骤c逆转录反应后的cDNA，分别根据步骤（4）a利用标准品质粒得到标准曲线和标准曲线方程，进而获得病毒上清样品或患者血清样品中登革病毒的拷贝数。