[发明专利]Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒诊断技术领域，具体涉及Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法。

背景技术

登革病毒(Dengus virus，DENV)是以埃及伊蚊和白纹伊蚊等为传播媒介的虫媒病毒，广泛流行于全球100多个热带和亚热带国家及地区，能引起登革热、登革出血热，甚至更为严重的登革休克综合征。登革病毒颗粒大小约50nm，其染色体RNA为单股正链核糖核酸，此病毒RNA共可以导引生成三个结构蛋白：核小蛋白，前膜(PrM)蛋白，外套膜蛋白，同时也引导生成七个非结构蛋白：NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5。登革病毒属于黄病毒科，根据抗原性不同可将登革病毒分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4)，其中以Ⅱ型登革病毒传播最为广泛。

近年来，由于全球气候变暖、人口流动频繁等因素，登革热的爆发和流行范围有逐年扩大和愈演愈烈之势，其在全球的发病率提高了近30倍。在过去两年中，在东南亚中部和南部地区、美洲以及西太平洋地区，超过100个国家的25亿人受到登革病毒的威胁，每年约1亿人感染登革病毒，约2.2万人死亡(主要是儿童)。2014年，仅中国广东省累计报告登革热病例超过3.87万例。登革热是过去50年间世界上最为严重的传染病之一，已成为严重的全球性公共卫生问题，不仅严重危害人类的健康，还为国家和个人带来沉重的经济负担。由于目前尚无可供使用的登革病毒疫苗用于预防，登革病毒的防控形式日趋严峻，因此建立和完善登革热分子流行病学诊断技术是一项迫在眉睫的任务。

目前，对登革病毒的病原学检测方法主要有血清学检测(包括免疫层析、ELISA、IgG/IgM抗体比率、IFA等)，NS1抗原检测以及实时荧光RT-PCR检测等。其中，通常采用的实时荧光RT-PCR检测可以对登革病毒进行分型，且敏感性较好，可以初步进行相对定量。但是该方法由于没有设计病毒拷贝数的标准对照参比品以及拷贝数计算体系，因而对于病毒绝对拷贝数的具体信息却未能知晓。

发明内容

本发明的目的在于提供一种Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒的荧光定量PCR绝对定量体系，不仅可以对实验体系中的病毒拷贝数进行绝对定量，更为重要的是在临床应用中，不仅可以快速断定登革热患者受到登革病毒感染，还可以对患者血清中的病毒拷贝数进行绝对定量，从而对登革热临床治疗效果的评价和患者的预后提供重要的参考依据。

本发明通过下列技术方案实现：一种Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒基因拷贝数的绝对定量检测方法，经过下列各步骤：

(1)Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒的接种培养：按1mL病毒液/瓶的量，将浓度均为4.0MOI/mL的Ⅱ型登革病毒液、Ⅲ型登革病毒液分别接种到生长致密、透明度好的白纹伊蚊C6/36细胞上，于温度为28±2℃、CO₂体积浓度为5％的环境中，恒温吸附1小时，于相同环境中，补加病毒液9倍体积的下列病毒维持液：RPMI-1640培养基+2％(w/v)小牛血清+0.12％(w/v)的碳酸氢钠溶液(NaHCO₃)，培养至第5天，随后于相同环境中，补加碳酸氢钠溶液直至碳酸氢钠含量为0.12％(w/v)，培养至第8～9天，当白纹伊蚊C6/36细胞病变效应(CPE)达++++时，收集细胞液，于4℃、3500×g离心分离5min，收获上清液，分别得Ⅱ型、Ⅲ型病毒液；

(2)构建Ⅱ型、Ⅲ型登革病毒标准品质粒：

a.根据NCBI数据库中Ⅱ型和Ⅲ型登革病毒标准株序列(GenBank:M29095.1；NC_001475)，按下述设计特异性引物：

Ⅱ型登革病毒前膜蛋白区域的PCR正、反向引物：

DENV-2For：5'-AAAAAGGCGAGAAATACGCC-3'

DENV-2Rev：5'-CACACAATTCACCAAGGTCCA-3'

Ⅲ型登革病毒前膜蛋白区域的PCR正、反向引物：

DENV-3For：5'-ACAGTTTCGACTCGG-3'

DENV-3Rev：5'-CTTTCATTCTTCCCC-3'；